Cromatografia, Daniele Naviglio « Chimica Analitica « Agraria

La cromatografia

Oggigiorno, dopo circa un secolo dalla loro scoperta, le tecniche cromatografiche sono di fondamentale importanza nell’ambito della chimica analitica strumentale. Esse contribuiscono a risolvere problematiche analitiche altrimenti non affrontabili. Si pensi all’analisi multiresiduale (Pesticidi, diserbanti, etc.) nella frutta e nelle verdure che consente di tenere sotto controllo l’impiego di sostanze (circa mille), in alcuni casi, molto tossiche per l’uomo e gli animali. La cromatografia è una tecnica nata per puro caso, ma che oggi è indispensabile per affrontare le problematiche analitiche che a loro volta diventano sempre più complesse e che richiedono la separazione perfino di composti chirali (Sostanze che differiscono solamente per la disposizione spaziale di sostituenti attorno ad un carbonio chirale oppure, più in generale, che non sono sovrapponibili, dette “Stereoisomeri”).

La scoperta della cromatografia viene attribuita al biochimico russo Mikhail Tswett che riuscì, nel 1906, a separare la clorofilla da un estratto vegetale.

Esperimento:
Tswett fece passare miscele di pigmenti colorati di origine vegetale attraverso una colonna di vetro riempita con carbonato di calcio.
I pigmenti si separarono in singole bande colorate lungo la colonna.
Il termine cromatografia deriva appunto dalla combinazione delle parole greche chroma (colore) e graphein (scrivere).

Con l’esperimento (figura a lato) Tswett mise in evidenza la possibilità di impiegare questo sistema di frazionamento, creando le basi della moderna cromatografia.

Cromatografia su colonna a pressione atmosferica. Fonte: UniPg

Cromatografia

Con il termine Cromatografia oggi si indicano tutte le varie tecniche separative e/o analitiche che si basano sulla distribuzione fra due fasi: una fase stazionaria (immobilizzata) ed una fase mobile (eluente).
Una specie chimica depositata sulla fase stazionaria e immessa nella corrente della fase mobile si distribuisce dinamicamente tra le due fasi, in misura proporzionale alla diversa affinità che possiede per esse.
La fase mobile è generalmente un liquido o un gas che scorre continuamente sopra la fase stazionaria fissa che può essere un solido o un liquido, trascinando con sé i soluti che costituiscono la miscela e realizzando la dinamica dell’estrazione in modo continuo.

Separazione dei composti di una miscela su colonna. Fonte: Polimi

Cromatografia liquida e gas cromatografia

FASE MOBILE→ LIQUIDA

↓

GASSOSA

FASE STAZIONARIA→ LIQUIDA
↓

SOLIDA
Dalle combinazioni tra la fase mobile e la fase stazionaria si ottengono quattro tecniche cromatografiche:
Cromatografia liquida: Liquido-solido; Liquido-liquido.
Cromatografia gassosa: Gas-liquido; gas-solido.

Il coefficiente di distribuzione

Si consideri un sistema formato da due fasi in cui viene introdotto un analita: esso si distribuirà tra le due fasi immiscibili, S e M, a seconda delle sue proprietà chimico-fisiche.
Indicando con C_M e C_S la concentrazione della sostanza nella fase mobile e nella fase stazionaria rispettivamente, e supponendo che le condizioni sperimentali siano tali da conseguire il raggiungimento di equilibri, è possibile, ad una determinata temperatura, rappresentare il coefficiente di distribuzione (K).

Il coefficiente di distribuzione (segue)

È dal valore di K che dipende il tempo di ritenzione, ossia il tempo necessario affinché un analita percorra l’intera fase stazionaria. Infatti, un’elevata concentrazione nella fase stazionaria, rispetto a quella nella fase mobile, indica una maggiore affinità per la prima.
Il altre parole, l’eluente incontrerà una certa difficoltà nel trascinare con se alcune sostanze, mentre altre più affini ad esso e meno verso la fase stazionaria, verranno dislocate dalle posizioni che occupano e trasportate verso la coda della colonna. In questo modo le sostanze meno affini per la fase stazionaria saranno separate da quelle maggiormente trattenute.

Processo di separazione Fonte: Angelo Aquilino

Principio su cui si basa la cromatografia

Si supponga di avere a disposizione 5 colonne riempite uniformemente di un materiale solido in granuli di dimensione omogenea (fase stazionaria). All’inizio della prima colonna si deposita un analita che possiede K=1; ciò vuol dire che esso si ripartisce equamente tra la fase fissa e la fase mobile.

Fasi

Fase 1: 1 mL di analita è aggiunto nel tubo 1.
Fase 2: essendo K=1, ad equilibrio raggiunto 0,50 mL saranno nella fase M e 0,50 mL saranno nella fase S. Tutta la fase mobile viene trasferita nel tubo 2 che avrà una quantità di analita pari a 0,50 mL.
Fase 3: essendo K=1 nel tubo 1 l’analita si ripartisce nella fase M e nella fase S in quantità pari a 0,25 e 0,25 mL rispettivamente. Nel tubo 2 la ripartizione tra le 2 fasi sarà uguale anch’essa a 0,25 e 0,25 mL. Adesso, se tutta la fase mobile del tubo 2 viene trasferita nel tubo 3, la concentrazione di analita nei tubi 2 e 3 sarà pari a 0,25 mL. Inoltre, se tutta la fase mobile del tubo 1 viene immessa nel tubo 2, la quantità di analita sarà pari a 0,50 mL nel tubo 2 e 0,25 mL nel tubo 1.
Fase 4: stesso discorso può essere fatto per questa fase. Raggiunto l’equilibrio la concentrazione dell’analita tra le 2 fasi è di 0,125 mL, 0,25 mL e 0,125 mL nei tubi 1, 2 e 3 rispettivamente. Quindi, se tutta la fase mobile del tubo 3 viene trasferita nel tubo 4, la quantità di analita in quest’ultimo è pari a 0,125 mL. Se tutta la fase mobile del tubo 2 viene trasferita nel tubo 3, la quantità di sostanza sarà pari a 0,375 mL, infine se tutta la fase mobile del tubo 1 viene trasferita nel tubo 2 la quantità di analita finale sarà pari a 0,375 mL. Nel tubo 1 rimarrano solo 0,125 mL di sostanza.
Fase 5: all’equilibrio, la quantità di sostanza presa in esame sarà di 0,0625 mL, 0,1875 mL, 0,1875 mL e 0,0625 mL nei tubi 1, 2, 3 e 4 rispettivamente. Se tutta la fase mobile del tubo 4 viene trrasferita nel tubo 5, la quantità di analita sarà pari a 0,0625 mL. Continuando, come visto nell’esempio 4, al termine dell’esperimento la quantità di sostanza sarà di 0,0625 mL, 0,250 mL, 0,375 mL, 0,250 mL e 0,0625 mL nei tubi 1, 2, 3, 4 e 5, rispettivamente.

Fasi (segue)

È possibile osservare che, dopo 5 tappe, il composto è distribuito lungo l’intera colonna, ma la zona di massima concentrazione appare al centro della colonna. Il tipo di distribuzione è di tipo “gaussiano”.
Più grande è il numero di equilibri che si succedono su una colonna, tanto maggiore diventa la concentrazione del composto in un determinato punto della colonna. Due sono, pertanto, i fattori principali che influenzano il quadro generale di una separazione:

dal coefficiente di distribuzione, quindi dalla velocità di cammino sulla colonna degli analiti;
dal numero di equilibri che si verificano.

La tabella mostra l'andamento della sostanza nei 5 tubi che si verifica durante l'esperimento. Ogni fase corrisponde ad un equlibrio.

Il cromatogramma

Il grafico a lato riporta l’andamento dell’analita, studiato precedentemente. È possibile verificare come i punti siano distribuiti secondo una gaussiana.
Il cromatogramma è il grafico prodotto da un’analisi cromatografica che correla la risposta del rivelatore del gascromatografo al tempo, ossia al volume di eluizione. Ogni picco rappresenta l’eluizione dei singoli analiti, separati dal processo cromatografico.

Andamento gaussiano delle concentrazioni dell'esperimento fondamentale della cromatografia e profilo gas cromatografico. Fonte: Wikipedia

Piatti Teorici e Piatti Effettivi

Il numero dei piatti teorici di una colonna cromatografica è ricavabile da

N = 16 (tR/wb)²

mentre facendo riferimento al tempo di ritenzione corretto, si definisce il numero dei piatti effettivi.

Neff = 16 (t‘R/wb)²

E’ importante precisare che N non è un parametro caratteristico per una data colonna, poiché dipende anche dalla sostanza eluita.
Ciò significa che una stessa colonna attraversata da due sostanze mostra due diversi valori di piatti teorici.

Piatti Teorici e Piatti Effettivi (segue)

Il grafico a lato riporta l’andamento dell’analita, studiato precedentemente. È possibile verificare come i punti siano distribuiti secondo una gaussiana.
Il cromatogramma è il grafico prodotto da un’analisi cromatografica che correla la risposta del rivelatore del gascromatografo al tempo, ossia al volume di eluizione. Ogni picco rappresenta l’eluizione dei singoli analiti, separati dal processo cromatografico.

Schematizzazione di una colonna e dei piatti teorici (Elementi di volume in cui si realizza l'equilibrio).

Piatti Teorici e Piatti Effettivi (segue)

La sostanza si sposta verso la fine della colonna attraverso il movimento della fase mobile, in equilibrio su un piatto, verso il piatto successivo.

È importante sottolineare che, a differenza della colonna di distillazione, i piatti non esistono realmente all’interno della colonna, sono solo un modello per facilitare la comprensione del processo che avviene.

Se si aumenta N, diminuisce il numero dei piatti teorici su cui si distribuisce ogni sostanza poiché aumentano gli equilibri a cui essa è sottoposta; a parità di lunghezza, si accorcia il tratto di colonna su cui si distribuisce ogni sostanza.

Piatti Teorici e Piatti Effettivi (segue)

L’efficienza di una colonna aumenta con il numero dei piatti: tanto maggiore è N, tanto più compatta è la banda in uscita e quindi tanto più è stretto il picco sul cromatogramma.
Aumentando i piatti→i picchi sono più stretti→si hanno migliori separazioni.
Il modo più semplice per aumentare il numero dei piatti consiste nell’aumentare la lunghezza della colonna ma ciò comporta un notevole aumento dei tempi di ritenzione.
In alternativa si deve trovare un modo di diminuire le dimensioni di un singolo piatto. A parità di lunghezza una colonna sarà più efficiente quando viene minimizzata l’altezza equivalente al piatto teorico

H = L/N

dove L è la lunghezza della colonna.

Ancora più adatta è la formula

Heff = L/Neff

Meccanismi sui quali si basa la separazione cromatografica

Adsorbimento
La fase stazionaria è un solido sulla cui superficie si trovano dei siti attivi in grado di stabilire dei legami secondari (dipolo-dipole, legami H, forze di Van der Waals) con le diverse molecole della miscela da risolvere (separare). Se la fase mobile è un liquido si definisce il tipo di cromatografia liquido-solido (LSC); se invece è un gas, di cromatografia gas-solido (GSC).
In genere, le molecole più facilmente fissate sono quelle che presentano gruppi polari, anche se la natura dell’adsorbente influisce sul fenomeno.

Schematizzazione del fenomeno dell'adsorbimento.

Meccanismi sui quali si basa la separazione cromatografica (segue)

Ripartizione

La fase stazionaria è un liquido, in cui si verifica una vera e propria solubilizzazione delle sostanze da analizzare. Esse pertanto si ripartiscono tra le due fsi (immiscibili tra loro). La fase mobile può essere un gas (GLC) o un liquido (LLC).
Inoltre, se la fase stazionaria è polare il tipo di cromatografia è detta a “fase normale”, se invece è apolare è detta a “fase inversa”.

Schematizzazione del fenomeno della ripartizione.

Meccanismi sui quali si basa la separazione cromatografica (segue)

Scambio Ionico

Si basa su un equilibrio di scambio ionico tra una resina (fase fissa) e una soluzione elettrolitica mobile. In particolare la fase stazionaria è costituita da macromolecole contenenti gruppi attivi dotati di carica elettrica (positiva o negativa) i quali sono in grado di scambiare i propri controioni (negativi o positivi, rispettivamente) con la soluzione da cui vengono lambiti

Schematizzazione del fenomeno dello scambio ionico.

Meccanismi sui quali si basa la separazione cromatografica (segue)

Esclusione Molecolare

La fase stazionaria è costituita da gel con pori di dimensioni controllate, la separazione è basata sulle dimensioni e sulla massa molecolare degli analiti.

Schematizzazione del fenomeno dell'esclusione molecolare.

Meccanismi sui quali si basa la separazione cromatografica (segue)

Affinità
Si usano reazioni di tipo biochimico, reversibili e molto specifiche, in modo che le molecole da separare interagiscano con la fase stazionaria.

Schematizzazione del fenomeno dell'affinità.

Schema generale di un cromatografo

Riserva di fluido;
Sistema di pompaggio;
Iniettore;
Colonna;
Rivelatore;
Registratore.

Lo schema appena rappresentato descrive un cromatografo utile sia per l’analisi gas-cromatografica che per cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).

Schema a blocchi di un apparecchiatura per cromatografia strumentale.

Gascromatografo

HPLC

Analisi qualitativa

Tutte le informazioni inerenti all’analisi qualitativa vengono fornite dal cromatogramma. Infatti, esso procura una sicura evidenza della eventuale presenza o assenza degli analiti.

Se l’analisi di un campione non produce un picco allo stesso tempo di ritenzione di quello di uno standard ottenuto nelle stesse identiche condizioni, si può concludere quasi certamente che il composto in questione è assente.
Un’altra tecnica si basa sull’arricchimento del campione con una piccola parte di analita puro, del quale si vuole escludere o meno la presenza. Se compare un nuovo picco nel cromatogramma, la specie nota non è presente nella miscela; viceversa l’analita è presente.

Le poche informazioni che provengono da un cromatogramma (il tempo di ritenzione soprattutto), non sempre permettono di risolvere campioni complessi di composizione non nota. Questa limitazione è superata interfacciando le colonne cromatografiche con spettrometri UV, IR o di massa.

Analisi quantitativa

L’analisi quantitativa si basa sul confronto delle altezze o delle aree dei picchi di un composto presente in un campione con quelle di uno o più standard. Generalmente l’area del picco è una misura più soddisfacente rispetto all’altezza.
Come è stato visto nelle lezioni precedenti, il metodo più diretto nell’analisi quantitativa consiste nella preparazione di una serie di soluzioni standard di concentrazione vicina a quella del campione. Vengono eseguiti i cromatogrammi degli standard e vengono riportate le altezze o le aree dei picchi in funzione della concentrazione.

Analisi gas cromatografica dei trigliceridi del burro

Analisi degli Esteri Metilici degli acidi Grassi dopo Transesterificazione dei Trigliceridi

Poiché l’analisi della componente trigliceridica risulta complessa in quanto sono presenti composti che differiscono di poco per le loro caratteristiche chimico-fisiche, si preferisce analizzare le matrici a composizione prevalentemente trigliceridica quali il burro, l’olio, lo strutto etc. per la loro distribuzione in acidi grassi.
E’ possibile fare ciò sottoponendo il grasso o l’olio ad una reazione di transesterificazione che rompe i trigliceridi e libera gli acidi grassi che sono presenti in essi.

L’analisi degli acidi grassi

La legge del 13 novembre 1960 n. 1407 suddivide gli oli in tre diverse categorie:

oli vergini;
oli rettificati;
miscele di oli vergini con oli rettificati.

Gli oli vergini sono quelli estratti dall’oliva esclusivamente per pressione o centrifugazione (mezzi meccanici e fisici), esclusi quelli ottenuti con solvente, coadiuvanti chimici o biochimici, con processi di riesterificazione e miscelazione con oli di natura diversa. Gli oli vergini si distinguono in quattro qualità a seconda dell’acidità:

olio extra vergine di oliva;
olio sopraffino vergine di oliva;
olio fino vergine di oliva;
olio vergine di oliva.

Frodi alimentari

La chimica analitica applicata all’analisi degli alimenti si propone di verificare da quali principi nutritivi i cibi risultano costituiti ed in quali proporzioni siano essi contenuti. Grazie ad essa è inoltre possibile verificare se gli alimenti posseggano quei requisiti di salubrità e genuinità prescritti dalla normativa vigente, oltre che di stabilire quali alterazioni e adulterazioni (frodi) gli alimenti stessi abbiano subito.
La parola frode alimentare è un termine generico che si riferisce alla produzione ed al commercio di alimenti non conformi alla normativa vigente; si suddividono in diverse categorie, quali:

adulterazione: variazione, non dichiarata, dei componenti di un alimento;
alterazione: modifiche delle caratteristiche chimico-fisiche e/o organolettiche di un alimento, dovute a processi naturali. Sono casi in cui la condotta umana può aver provocato l’episodio, ma in modo colposo e non doloso. ;
contraffazione: l’alimento viene posto in commercio con una composizione o con valori diversi rispetto a quelli dichiarati;
frode alimentare: consiste nel riportare indicazioni errate in etichetta;
frode sanitaria: atto che rende nocivi i cibi (aggiunta di metanolo nel vino, ad esempio);
sofisticazione: operazione fraudolenta che si attua sostituendo alcuni ingredienti con altri di minor pregio.

Le frodi più comuni dell’olio

extravergini non puri, contenenti cioè oli raffinati, di oliva e di semi.
oli di sansa decerati a freddo con acetone;
oli con parametri analitici non conformi alla classificazione;
oli di semi (anche geneticamente modificati) commercializzati come oli di oliva;
miscelazione di oli di oliva con oli esterificati (dichiarati non commestibili);
miscelazione di oli di semi con olio fortemente colorato (verdone).

L’analisi gascromatografica degli acidi grassi (come esteri metilici) permette di ottenere un cromatogramma con picchi ben visibili per tutti gli acidi grassi, anche quelli presenti in tracce o con isomeria differente (è possibile distinguere gli isomeri cis- dagli isomeri trans-). Con particolari colonne capillari, poi, si può ottenere un cromatogramma dove si distingue il picco caratteristico dell’acido elaidinico, indice di un olio non ottenuto da pressione ma proveniente da esterificati, da oli rettificati oppure da oli di sansa rettificati.

Trans-esterificazione

Gli acidi grassi dei gliceridi presenti nell’olio vengono trasformati, mediante trans-esterificazione, nei rispettivi esteri metilici, che presentano una maggiore volatilità rispetto al trigliceride tal quale.