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Olimpia Pepe » 12.Rapporti simbiontici piante-microrganismi: azotofissatori e micorrize


Fissazione biologica dell’azoto

Una fase fondamentale del ciclo dell’azoto è la riduzione dell’azoto atmosferico (N2) in NH3 (fissazione).

La fissazione biologica dell’azoto rappresenta un vantaggio ecologico per i microrganismi azotofissatori in quanto la loro crescita è indipendente dalla presenza di azoto ridotto precostituito. Essi possono così avere a disposizione azoto fissato ridotto da utilizzare nelle biosintesi incorporandolo nei composti organici.

Tale processo rende i composti dell’azoto disponibili per le biosintesi microbiche e per le piante. L’azotofissazione è effettuata da specifici microrganismi procarioti che possono essere distinti in tre gruppi:

  • Azotofissatori liberi: batteri e archea; aerobi ed anaerobi; non formano nessuna associazione con le piante; si ritiene che essi siano deboli fissatori; es. generi Azotobacter spp. (aerobi eterotrofi); Clostridium spp. (anaerobio); Anabaena spp., Gleocapsa spp. e Rhodospirillum spp. (fototrofi).
  • Azotofissatori liberi associati: sono azotofissatori che si associano alle radici delle graminacee (climi tropicali) ma non formano noduli radicali; es. genere Azospirillum.
  • Azotofissatori simbionti con formazione di noduli radicali:
    • associazioni simbiontiche con le leguminose; sono potenti fissatori; es.Rhizobium leguminosarum, Bradyrhizobium iaponicum;
    • associazioni con non leguminose; es. Frankia spp.

La nitrogenasi

Il processo di azotofissazione è un processo che richiede molta energia per attivare la molecola di azoto gassoso che è piuttosto inerte per la presenza di un triplo legame.

La riduzione dell’azoto gassoso è catalizzato dal complesso enzimatico della Nitrogenasi costituito da 2 subunità proteiche contenenti ferro e/o molibdeno:

  • dinitrogenasi reduttasi (Fe-proteina);
  • dinitrogenasi (Mo-Fe-proteina) (Fig. 1).

Nitrogenasi alternative: alcuni azotofissatori sintetizzano delle nitrogensi modificate in cui il molibdeno è sostituito dal vanadio.

Ciò garantisce al microrganismo la possibilità di fissare azoto anche quando nell’ambiente la quantità di molibdeno è limitante.

Figura 1. Complesso della nitrogenasi costituito da dinitrogenasi reduttasi e dinitrogenasi

Figura 1. Complesso della nitrogenasi costituito da dinitrogenasi reduttasi e dinitrogenasi


Meccanismi di protezione

Meccanismi di difesa dall’O2 della Nitrogenasi

La nitrogenasi è inattivata rapidamente e irreversibilmente dall’O2, in particolare della dinitrogenasi reduttasi.

I batteri aerobi azotofissatori hanno sviluppato e utilizzano uno o più meccanismi in grado di tenere lontano l’O2 dal sistema enzimatico:

  • aumento del tasso di respirazione e complessazione con una proteina specifica (protezione conformazionale) (Azotobacter, Azomonas);
  • produzione di sostanze mucose, mucillaginose o gomme che impediscono la penetrazione dell’ossigeno (Beijerinkia, Azotobacter, Azomonas) (Fig. 2 e 3);
  • compartimentalizzazione del citoplasma e localizzazione della nitrogenasi in cellule specializzate differenziate (es. Frankia, cianobatteri);
  • produzione di leghemoglobina (Rhizobium).
Figura 2. Effetto della bassa (a) ed alta (b) concentrazione di ossigeno su Azotobacter

Figura 2. Effetto della bassa (a) ed alta (b) concentrazione di ossigeno su Azotobacter

Figura 3. Produzione di materiale mucillaginoso da parte di azotobatteri

Figura 3. Produzione di materiale mucillaginoso da parte di azotobatteri


Processo di azotofissazione

Il processo di fissazione dell’azoto gassoso e flusso di elettroni

Il processo di fissazione dell’azoto è:

  • altamente riduttivo;
  • inibito dall’ossigeno;
  • molto costoso in termini di energia di attivazione in quanto l’azoto molecolare è un composto inerte data la presenza di un triplo legame molto stabile.

Per ridurre l’azoto a ammoniaca devono essere trasferiti sei elettroni e formati diversi intermedi. Il flusso di elettroni prevede quattro differenti tappe:

  • Donatore di elettroni (ferrodossina o flavodossina);
  • Dinitrogenasi reduttasi;
  • Dinitrogenasi;
  • N2 (Fig. 4).

Durante il passaggio degli elettroni all’N2 si ha il consumo di 16-24 moli di ATP per mole di N2 fissato (Fig. 4).

Figura 4. Fasi del processo di fissazione dell’azoto e reazione globale

Figura 4. Fasi del processo di fissazione dell'azoto e reazione globale


Regulone Nif

Regolazione del processo di azotofissazione

La sintesi e l’attività della nitrogenasi sono regolati da 20 geni localizzati in un regulone Nif (un insieme di operoni correlati).

Sono presenti:

  • geni strutturali per il complesso della nitrogenasi;
  • geni per il Fe-Mo-Co ;
  • geni che controllano le proteine implicate nel trasporto degli elettroni;
  • geni regolatori;
  • geni NifD e NifK preposti alla sintesi delle subunità alfa e beta della dinitrogenasi, rispettivamente;
  • gene NifH codifica per l’enzima dinitrogenasi reduttasi. Alla sintesi del cofattore Fe-Mo-Co partecipano diversi geni Nif N, V, Z, W, E, B, e Q (Fig. 5).

La regolazione della nitrogenasi avviene a livello della trascrizione dei geni Nif strutturali. E’ attivata dalla proteina A (regolazione positiva; gene Nif A) ma è inibita dalla proteina L (regolazione negativa; gene Nif L) in presenza di O2.

Figura 5. Geni per la nitrogenasi del regulone Nif in Klebsiella pneumoniae

Figura 5. Geni per la nitrogenasi del regulone Nif in Klebsiella pneumoniae


Azotofissazione simbiontica

Gli azotofissatori simbionti delle leguminose

Gli azotofissatori simbionti (rizobi) possono infettare le radici delle leguminose con formazione di noduli radicali sede del processo di azoto-fissazione.

Sono batteri Gram-negativi appartenenti ai generi: Rhizobium, Bradirhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, Azorhizobium.

Il genere Rhizobium è coinvolto nella formazione di noduli radicali delle piante di zone temperate.

Esiste una stretta specificità tra la specie di leguminosa e la specie di Rhizobium che la infetta.

In base alla specificità di nodulazione i rizobi possono essere:

  • efficaci, che determinano la formazione di grossi noduli radicali, rossi e attivi;
  • inefficaci, che determinano la formazione di piccoli noduli, biancastri ed inattivi (Fig. 6).
Figura 6. Noduli radicali rossastri attivi (a sinistra) e biancastri inattivi (a destra)

Figura 6. Noduli radicali rossastri attivi (a sinistra) e biancastri inattivi (a destra)


Formazione del nodulo

Fasi del processo di formazione del nodulo in Rhizobium

RICONOSCIMENTO

Le radici emettono essudati non specifici che stimolano la crescita dei batteri e anche del Rhizobium, e molecole segnale specifiche che sono costituite da flavonoidi che attirano i rizobi e attivano i geni della nodulazione (Nod).

ADESIONE E INFEZIONE

Legame del batterio ai peli radicali mediante la formazione delle proteine ricadesina e lectina presenti sulla superficie delle cellule dei rizobi.

Il pelo radicale si ripiega (arricciamento) in seguito al rilascio da parte dei rizobi di sostanze denominate “fattori nod”. L’invasione parte dall’apice del pelo radicale e i rizobi sono incapsulati in una sacca della parete cellulare (Fig. 7).

Figura 7. Fasi di riconoscimento, adesione ed infezione in Rhizobium

Figura 7. Fasi di riconoscimento, adesione ed infezione in Rhizobium


Formazione del nodulo II

Fasi del processo di formazione del nodulo in Rhizobium

PENETRAZIONE

I rizobi penetrano nel pelo radicale e inducono la pianta a produrre poligalatturonidasi che idrolizza la pectina vegetale.

La pianta reagisce producendo uno strato di cellulosa che delimita i batteri.

In tal modo si forma un canale detto “filo di infezione” rivestito da cellulosa che si approfondisce all’interno della radice e attraverso il quale i rizobi migrano verso le cellule corticali (Fig. 8).

Figura 8. Formazione del filo di infezione da parte Rhizobium leguminosarum in trifoglio

Figura 8. Formazione del filo di infezione da parte Rhizobium leguminosarum in trifoglio


Formazione del nodulo III

Fasi del processo di formazione del nodulo in Rhizobium

FORMAZIONE DEL BATTEROIDE

Le cellule di rizobi presenti all’interno delle cellule vegetali si trasformano assumendo una forma irregolare e rigonfia detta batteroide (Fig. 9).

Uno o più batteroidi possono essere racchiusi dalla pianta ospite in porzioni della membrana plasmatica (membrana peribacteroidea), formando delle vescicole dette simbiosomi.

Nei simbiosomi avviene la fissazione dell’azoto e scambi di nutrienti con la cellula vegetale che devia parte dei fotosintetati (succinato, malato e fumarato) che fungono da donatori di elettroni per la produzione di ATP e per la riduzione dell’N2 da parte dei batteri.

Figura 9. Batteroidi all’interno di un nodulo radicale

Figura 9. Batteroidi all'interno di un nodulo radicale


Formazione del nodulo IV

Fasi del processo di formazione del nodulo in Rhizobium

FORMAZIONE DEL NODULO RADICALE

La formazione del nodulo radicale da parte dei rizobi è regolato dai geni Nod contenuti in plasmidi Sym (simbiosi).

I rizobi producono delle “middle protein” che inducono le cellule corticali “target” a passare da uno stadio diploide ad uno tetraploide formando un meristema in crescita che si rigonfia verso l’esterno fino alla formazione del nodulo.

Se le cellule corticali “target” rimangono diploidi, l’infezione dà luogo a necrosi delle cellule stesse.

Nei noduli i batteroidi sono circondati dalla leghemoglobina sostanza di colore rosso che contiene ferro in grado di mantenere costanti i livelli di O2 (Fe+3 a Fe+2).

La leghemoglobina può formarsi solo dopo interazione tra la pianta, che fornisce la porzione globinica, e il microrganismo, che porta il gruppo eme (Fig. 10).

Figura 10. Formazione del filo d’infezione, dei batteroidi e del nodulo radicale in Rhizobium

Figura 10. Formazione del filo d'infezione, dei batteroidi e del nodulo radicale in Rhizobium


Regolazione del processo di nodulazione

I geni Nod dirigono tappe specifiche della nodulazione e sono localizzati su plasmidi di grandi dimensioni detti Sym. Tali geni determinano anche la specificità d’ospite.

Il gene NodD codifica per la sintesi di molecole che fungono da induttori della nodulazione come i flavonoidi e controlla la trascrizione degli altri geni Nod (Fig. 11).

Nel plasmide mostrato in figura 10 i geni Nod sono localizzati tra due gruppi di geni Nif.

I geni NodABC sono preposti alla sintesi di oligosaccaridi detti fattori Nod che inducono l’arricciamento del pelo radicale e stimolano la divisione delle cellule radicale. La specificità dell’ospite è determinata dalla struttura specifica dei fattori Nod prodotti da una determinata specie di Rhizobium.

Figura 11. Organizzazione dei geni Nod sul plasmide Sym di Rhizobium leguminosarum

Figura 11. Organizzazione dei geni Nod sul plasmide Sym di Rhizobium leguminosarum


Effetto della nodulazione sulla crescita delle piante

La fomazione di noduli radicali attivi (Fig. 12) da parte dei rizobi è molto importante in agricoltura in quanto permette di aumentare, in modo naturale, la quantità di azoto combinato nel suolo.

Le leguminose nodulate possono crescere anche in suoli spogli, non fertilizzati, spesso carenti di azoto.

L’aggiunta di inoculi di rizobi permette di migliorare la pigmentazione e la crescita delle leguminose (Fig. 13).

Figura 12. Noduli radicali attivi formati da Bradyrhizobium sp. su pianta di arachide

Figura 12. Noduli radicali attivi formati da Bradyrhizobium sp. su pianta di arachide

Figura 13. Crescita della soia nodulata (a destra) e non nodulata (a sinistra)

Figura 13. Crescita della soia nodulata (a destra) e non nodulata (a sinistra)


Le micorrize

Micorrize= fungo della radice; associazione simbiontica che si instaurano tra le radici di molte piante (erbacee, arbustive ed arboree) e funghi del terreno.

La pianta fornisce ai funghi simbionti carboidrati semplici prodotti con la fotosintesi (essudati radicali) indispensabili al loro metabolismo.

I funghi micorrizici producono fattori di crescita vegetali che inducono alterazioni morfologiche delle radici stimolando la formazione dello strato micorrizico.

La specio-specificità è bassa in quanto una specie di pianta può formare associazioni micorriziche con diversi funghi.

Benefici per la pianta:

  • estendono il sistema radicale con maggior sviluppo delle radici (Fig. 14);
  • migliorano l’efficienza di assorbimento di nutrienti e ioni (P e N) soprattutto nei suoli umidi;
  • favoriscono l’assunzione dell’acqua negli ambienti aridi;
  • esercitano un’azione di protezione nei confronti di stress abiotici e biotici (maggiore resistenza ai patogeni).
Figura 14. Piante inoculate con (a sinistra) e senza (a destra) micorrize

Figura 14. Piante inoculate con (a sinistra) e senza (a destra) micorrize


Ectomicorrize o Micorrize Ectotrofiche (ME)

Infezione intercellulare superficiale tipico dei tartufi e dei porcini.

Le ife non penetrano mai all’interno delle cellule dell’ospite ma rivestono i tessuti radicali con una guaina di feltro micelico (reticolo di Hartig) formando uno spesso strato di ife attorno alle radici di piante arboree forestali come latifoglie e conifere Fig. 15).

Le ectomicorrize si trovano associate soprattutto ad alberi dei boschi, in special modo a conifere, faggi e querce e sono maggiormente sviluppate nelle foreste boreali e temperate. Le radici di tali piante sono colonizzate dai funghi.

Ospite: piante forestali delle zone temperate (Fig. 16) ed alcune erbacee (Polygonum).

Fungo: Basidiomiceti (Boletus), alcuni Zigomiceti e Ascomiceti (Tuber).

Figura 15. Ectomicorrize: crescita extracellulare di funghi

Figura 15. Ectomicorrize: crescita extracellulare di funghi

Figura 16. Radice ectomicorrizica con un fungo rizomorfo

Figura 16. Radice ectomicorrizica con un fungo rizomorfo


Endomicorrize o micorrize Vescicolari-Arbuscolari (MAV)

Formazioni presenti all’interno delle cellule vegetali intracellulare delle ife fungine fino anche a raggiungere il cilindro centrale. Durante la crescita si ha la formazione di ramificazioni fungine derivanti da biforcazioni ripetute (strutture simili ad alberi o arbuscoli) e rigonfiamenti ovoidi (vescicole) delle ife (Fig. 17).

Non dotate di mantello fungino esterno (Fig. 18).

Molto diffuse anche tra le specie erbacee.

Pianta ospite: molte piante agrarie (leguminose e graminacee), anche felci ed equiseti.

Fungo ospite: Zigomiceti (Glomus).

Infezione: il simbionte penetra nel cortex ma la morfologia esterna rimane inalterata.

Alcune piante (Corylus, Populus, Salix) vengono micorrizate sia da ME che MAV.

Figura 17. Endomicorrize: crescita intracellulare di funghi

Figura 17. Endomicorrize: crescita intracellulare di funghi

Figura 18. Estensione micorriziale dovuto allo sviluppo del fungo Suillus bovinus

Figura 18. Estensione micorriziale dovuto allo sviluppo del fungo Suillus bovinus


I materiali di supporto della lezione

Perry et al., Vol. 2, Cap. 25

Brock et al., Vol 2, Cap. 20

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