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Francesco Villani » 15.Batteri patogeni trasmessi con gli alimenti: Bacillus cereus. Clostridium botulinum e perfringens


Genere Bacillus

Caratteristiche

  • Bastoncini Sporigeni Gram-positivi. (In cellule vecchie è variabile)
  • Catalasi e ossidasi positivi
  • Aerobi stretti o aerobi-anaerobi facoltativi
  • Di solito mobili per ciglia peritriche
  • Sviluppano bene su terreni nutritivi ordinari
  • Forme vegetative: pH ottimale tra 6 e 8
  • Temperatura di crescita: 30-55°C

Tre gruppi in funzione della forma e posizione della spora nel corpo microbico:

I – Spora centrale o sub-terminale, non rigonfia, non deformante il corpo microbico.

II – Spora centrale o sub-terminale, ovale, rigonfia a parete spessa deformante il batterio.

III – Spora terminale, sferica, rigonfia a parete spessa (bacillo a forma di spillo).

Caratteristiche della spora

  • Le endospore di Bacillus sono strutture del batterio che gli consentono di sopravvivere in condizioni ambientali estreme.
  • Le spore hanno uno strato esterno di cheratina che le rende estremamente resistenti al calore, alle radiazioni, alla essiccazione, ai disinfettanti e ad altre sostanze chimiche.
  • Data la loro resistenza sono molto difficili da eliminare rappresentando una importante fonte di contaminazione degli alimenti.
Strutture della spora batterica

Strutture della spora batterica


Ciclo di sviluppo di un batterio sporigeno (figura 15b)

15b) Ciclo di sviluppo di un batterio sporigeno

15b) Ciclo di sviluppo di un batterio sporigeno


Bacillus cereus

Caratteristiche

  • Bacillus cereus è ampiamente distribuito in natura.
  • Comune ospite del suolo, può ritrovarsi nel pulviscolo, nei vegetali, nei materiali fecali animali ed umani.
  • Il suo isolamento nel corso di broncopolmoniti, batteriemie, setticemie, meningiti, infezioni dell’orecchio e delle vie urinarie, lo fa ritenere un patogeno di una certa rilevanza.
  • In particolare, per il ruolo svolto in congiuntiviti acute, iridocicliti purulente, panoftalmie emorragiche, endoftalmiti postraumatiche e metastatiche, anche a carattere fulminante, è considerato uno dei microrganismi più pericolosi per l’organo visivo.
  • Pur essendo mesofilo è stata dimostrata la possibilità di crescita di ceppi tossinogeni tra 4 e 37°C e tra 6 e 21°C.
  • La germinazione delle spore avviene tra 5 e 50°C, con velocità massima a 30°C.

Bacillus cereus – Caratteristiche

Caratteristiche

Caratteristiche


Caratteristiche della malattia

Bacillus cereus produce due tipi di malattie, la sindrome diarroica e la sindrome emetica.

Caratteristiche della malattia

Caratteristiche della malattia


Sindrome diarroica

  • B. cereus è in grado di produrre nella fase di crescita esponenziale una enterotossina di natura proteica, stabile a 45°C per 10 min, ma inattivabile a 56 °C in 5 min.
  • L’azione enterotossica induce la perdita di liquidi dalla mucosa intestinale.
  • L’enterotossina ingerita con gli alimenti viene di norma distrutta a livello gastrico e/o intestinale e, quindi, difficilmente può determinare intossicazione.
  • Si ritiene, perciò, che l’intossicazione diarroica sia da associarsi prevalentemente all’ingestione di cellule allo stato vegetativo e/o di spore ed alla successiva crescita del bacillo con conseguente produzione di enterotossina a livello dell’ileo.
  • La sindrome diarroica, si manifesta generalmente entro 6-15 ore dall’ingestione dell’alimento contaminato, mima l’intossicazione da Clostridium perfringens.

Sindrome emetica

B. cereus, durante la sporulazione, produce anche una tossina ad attività emetica, costituita da un piccolo peptide, di peso molecolare inferiore a 5000, stabile a 121 °C per 90 min ed a pH compresi tra 2 e 11, insensibile all’azione di tripsina e pepsina, attualmente ancora non isolata allo stato puro.

La sindrome emetica si presenta simile a quella causata da Staphylococcus aureus, con nausea e vomito, e solo di rado dissenteria, che compaiono generalmente entro 2-6 ore, con punte estreme tra i 15 minuti e le 11 ore, e perdurano di solito per 8-24 ore.

Bacillus cereus e alimenti

Fonti di contaminazione degli alimenti

Spore veicolate dal terreno e la polvere.

  • Latte crudo, pastorizzato, UHT e in polvere
  • Carne cruda e congelata di bovino, suini e pollame
  • Prodotti carnei freschi e stagionati
  • Riso (produzione di tossina emetica)
  • Uova intere, crude e pastorizzate
  • Prodotti da forno
  • Spezie
  • Insalate

Possibilità delle spore di sopravvivere ai trattamenti UHT.

Pastorizzazione: insufficiente ad eliminare le spore. Mancata competizione per eliminazione della microflora non sporigena.

Bacillus cereus e alimenti

Bacillus cereus e alimenti


Caratteristiche di crescita

  • pH (valori minimi-massimi): tra 4,9 e 9,3
  • In skim milk a pH 5,5 e a 30°C: tempo di generazione di 45 min
  • In skim milk a pH 6,5 e a 30°C: tempo di generazione di 26 min
  • In brodo triptone a pH 4,8 e a 30°C: nessuna crescita
  • In brodo triptone a pH 5,0 e a 30°C: tempo di generazione di 104 min

Attività dell’acqua

  • 0,95 – in glucosio+estratto di lievito + NaCl: crescita in 72 ore
  • 0,94 – in glucosio+estratto di lievito + glicerolo: crescita in 24 ore
  • 0,93 – in glucosio+estratto di lievito + glicerolo : crescita in 72 ore
  • 0,92 – in glucosio+estratto di lievito + glicerolo : no crescita in dopo 28 giorni

Bacillus cereus – Ricerca e identificazione

Per una migliore comprensione degli argomenti trattati in questa sezione, si consiglia di fare riferimento agli argomenti trattati nelle letture specifiche dedicate al Laboratorio di Microbiologia degli Alimenti (lezioni da 25 a 34 – Laboratorio 1-Laboratorio 10).

Procedura

Procedura


Bacillus cereus – Ricerca e identificazione

Identificazione

Identificazione


Il genere Clostridium

Caratteristiche

Il genere Clostridium è classificato nella Famiglia delle Clostridiaceae:

  • Bastoncini Gram-positivi sporigeni
  • Mobili per flagelli peritrichi o immobili
  • Anaerobi stretti e Catalasi negativi

Classificazione semplificata

In base alla posizione della spora all’interno dello sporangio e la capacità di liquefare la gelatina:

CLOSTRIDI (spore centrali o subterminali)

  • GRUPPO I – glucidolitici non proteolitici
  • GRUPPO II – glucidolitici, poco proteolitici
  • GRUPPO III – glucidolitici e molto proteolitici

PLECTRIDI (spora terminale)

  • GRUPPO IV

Clostridium botulinum

Caratteristiche

  • Bastoncino sporigeno
  • Gram-positivo
  • Anaerobio stretto
  • Catalasi negativo

La specie è composta da ceppi con diverse caratteristiche colturali e fenotipiche, ma tutte accomunate dalla capacità di produrre tossine ad azione neurotossica.

I ceppi di Clostridium botulinum sono designati in base al tipo di tossina prodotta (tipo A, tipo B, ecc.), anche se due ceppi dello stesso tipo (stessa tossina) possono appartenere a gruppi diversi.

Caratteristiche dei ceppi produttori di tossine botuliniche

Generalmente, un ceppo produce una singola tossina. In alcuni casi lo stesso ceppo può produrre più di una tossina. I ceppi responsabili di botulismo nell’uomo appartengono ai gruppi I e II.

Caratteristiche dei ceppi produttori di tossine botuliniche

Caratteristiche dei ceppi produttori di tossine botuliniche


Botulismo

Deriva dal latino “botulus”= salsiccia.

In base alle modalità di acquisizione della tossina:

  • botulismo alimentare: ingestione della tossina preformata nell’alimento (intossicazione)
  • botulismo da ferita: causato dall’organismo che si moltiplica e produce tossina nella ferita contaminata
  • botulismo infantile: causato dalla produzione della tossina in seguito alla germinazione delle spore nell’intestino

Le neurotossine botuliniche hanno un effetto paralizzante a seguito del blocco della liberazione di acetilcolina a livello presinaptico delle giunzioni mioneurali colinergiche (muscolatura liscia).

I sintomi si manifestano fra 2 e 24 ore dopo l’ingestione dell’alimento contaminato e sono rappresentati da paralisi oculare, disturbi dell’equilibrio, dilatazione delle pupille, visione doppia, carenza di salivazione, disturbi della deglutizione e fonazione, costipazione e spesso ritenzione di urina, paralisi dei muscoli respiratori.

La tossina botulinica

Le tossine sono prodotte durante la crescita del microrganismo e vengono rilasciate durante la lisi delle cellule.

  • E’ prodotta intatta intracellularmente ed escreta in seguito a lisi cellulare come una proteina di peso molecolare di circa 150000 Dalton (bassa tossicità)
  • E’ idrolizzata extracellularmente da tripsina o enzimi simili in due subunità (processo di tripsinizzazione che attiva l’azione biologica della tossina): catena leggera L di 50000 Da e catena pesante H di 100.000 Da, tenute insieme da un ponte disolfuro. Il processo di tripsinazione determina un aumento della tossicità della molecola

Esercita la sua azione con fissazione della subunità H ai gangliosidi e successiva internalizzazione della subunità L (a cui è dovuto l’effetto tossico) nella parte terminale del neurone con blocco del processo di accoppiamento tra acetilcolina e stimolo nervoso con conseguente paralisi.

La tossina botulinica (figura 15c)

15c) Struttura della tossina botulinica

15c) Struttura della tossina botulinica


Clostridium botulinum e alimenti

Ecologia

  • Terreno: tipi A e B maggiormente presenti nel terreno, determinando contaminazione di frutta e vegetali.
  • Sedimenti marini: tipo E colonizza gli ambienti marini contaminando più facilmente i prodotti della pesca.

Numero di casi e principali alimenti coinvolti in botulismo

Numero di casi e principali alimenti coinvolti in botulismo

Numero di casi e principali alimenti coinvolti in botulismo


Caratteristiche di crescita

Caratteristiche di crescita

Caratteristiche di crescita


Termoresistenza delle spore

C. botulinum Gruppo I

  • D100: 30 min con z=10°C
  • D121: 0,21 min con z=10°C

C. botulinum Gruppo II

  • D82: 2-3 min con z=6-7°C

Le tabelle di sterilizzazione stabilite dall’industria conserviera sono calcolate in modo da avere un tasso di riduzione decimale di spore botuliniche termoresistenti pari a 1012 UFC (12D).

Questo comporta un trattamento termico a 121°C per 2,5 min.

  • essendo D121= 0,21 min allora F0 (0,21×12)=2,5

F0, esprime la letalità totale di una popolazione di 1012 spore termoresistenti di botulino.

Prevenzione e controllo

In molti casi risulta impraticabile o indesiderabile trattare un alimento in maniera tale da eliminare tutte le spore di C. botulinum.

La maggior parte dei metodi di controllo mirano ad inibire la crescita e la produzione di tossine che negli alimenti è dipendente da:

  • temperatura
  • pH
  • attività dell’acqua
  • potenziale redox
  • conservanti
  • microrganismi competitivi

Tutti questi fattori, come è noto, sono interrelati: cambiando un fattore si influenza l’effetto degli altri.

Prevenzione e controllo

Tempertura

  • I ceppi del Gruppo I (tipi ABF) non crescono a T < a 10°C (opt. 40°C).
  • I ceppi del Gruppo II (tipi BEF) crescono anche T di 3,3°C (opt. 30°C).

pH

  • I ceppi del Gruppo II (BEF) non crescono a pH < 4,7-5,0

Alimenti proteici (soia, carne) potrebbero contenere delle “tasche” a bassa acidità in cui il pH potrebbe essere più alto e supportare la crescita e la produzione di tossine.

Gli alimenti cosiddetti ad alta acidità (pH<4,5) sono ritenuti generalmente più sicuri di altri i cui i valori di acidità permettono lo sviluppo di microrganismi indesiderati. Gli alimenti ad alta acidità possono essere trattati al calore meno drasticamente, in quanto l’acidità inibisce la germinazione delle eventuali spore sopravvissute al trattamento.

Prevenzione e controllo

Aw

Valori di aw < a 0,94 inibiscono crescita e produzione di tossine.

L’attività dell’acqua può essere abbassata mediante disidratazione, zuccheraggio o salagione (10% NaCl: aw di 0,94)

Potenziale Redox

Crescita: -350 mV; la produzione di tossine è stata osservata anche a +250 mV. La conservazione sotto vuoto aumenta le condizioni anaerobiche potendo consentire la produzione di tossina.

Conservanti

Inibiscono la crescita di C. botulinum, limitando la produzione di tossine: nitriti, acido sorbico, antiossidanti fenolici, ascorbati.

Prodotti in scatola

  • Per la conservazione di alimenti a bassa acidità (pH>4,5) sono necessari trattamenti ad alte pressioni per distruggere le spore.
  • Le tossine possono essere distrutte mediante bollitura per 10 min.

Clostridium botulinum

Ricerca e identificazione

Per una migliore comprensione degli argomenti trattati in questa sezione, si consiglia di fare riferimento agli argomenti trattati nelle letture specifiche dedicate al Laboratorio di Microbiologia degli Alimenti.

Procedura

La ricerca delle spore così come la determinazione delle neurotossine negli alimenti deve essere praticata da laboratori specializzati e autorizzati, vista la pericolosità della tossina.

Per la ricerca delle tossine si ricorre a test di immunodiffusione o al Mouse Neutralization Test, biosaggio che consiste nell’iniettare estratti dell’alimento, neutralizzati e non con antitossine specifiche, in cavie da laboratorio e rilevandone i sintomi.

Clostridium perfringens

Caratteristiche

Bastoncino sporigeno, Gram-positivo, Catalasi, negativo, Anaerobio stretto (anche se può sopportare concentrazioni di O2 fino al 5%).

Caratteristiche

Caratteristiche


Caratteristiche

  • La sporulazione dipende dal substrato nutritivo e dal pH.
  • Le spore sono ovali, centrali o sub-terminali, deformanti lo sporangio.
  • E’ un microrganismo largamente diffuso in natura. La sua grande distribuzione è legata alla dispersione nell’ambiente delle spore e alla loro resistenza a diversi fattori ambientali.
  • Il microrganismo presenta tassi di crescita elevati alla temperatura ottimale di sviluppo (tempi di raddoppiamento di 8-10 min a 45°C).
  • E’ stato ritrovato inoltre nel tratto intestinale di molti animali, compreso l’uomo.

I ceppi di Clostridium perfringens sono divisi in 5 tipi: (da A a E)

Tipo A: suolo e tratto intestinale di animali; responsabile di avvelenamenti alimentari nell’uomo.

Tipo C: sembra poter essere trasmesso per via alimentare, ma solo in zone circoscritte del mondo (es.: Papua Nuova Guinea).

Altri tipi: potenziali parassiti intestinali obbligati di vari animali.

Tossinfezione alimentare

  • Causa: dovuta ad una enterotossina prodotta nel corso della sporulazione del microrganismo.
  • Sintomi: dopo 8-12 ore dall’ingestione dell’alimento contaminato con un elevato numero di cellule o spore (106-108); diarrea profusa e forti dolori addominali, raramente accompagnati da febbre, nausea o vomito.
  • Enterotossina: proteina di 34.000 Da, che viene disattivata al calore (60°Cx10 min), da enzimi proteolitici e dagli acidi.
  • Meccanismo: accumulo di liquidi, azione citotossica su cellule VERO.
  • Tossinfezione: principalmente associata al consumo di carne rossa e pollame. La macellazione è un momento quasi inevitabile di contaminazione.
  • Comune fonte della malattia: alimenti non cotti a sufficienza, contaminati da spore termoresistenti e mantenuti alle temperature di crescita del microrganismo per lungo tempo.

Clostridium perfringens e alimenti

Caratteristiche di crescita e delle spore

Le caratteristiche di termoresistenza variano da ceppo a ceppo:

  • spore più termoresistenti: D90= 15-145 min con z= 9-16 °C
  • spore meno termosensibili: D90= 3-5 min con z= 6-8 °C
Caratteristiche di crescita e delle spore

Caratteristiche di crescita e delle spore


Clostridium perfringens

Ricerca e identificazione

Per una migliore comprensione degli argomenti trattati in questa sezione, si consiglia di fare riferimento agli argomenti trattati nelle letture specifiche dedicate al Laboratorio di Microbiologia degli Alimenti.

Procedura

Procedura


Considerazioni conclusive

Bacillus cereus, Clostridium botulinum e Cl. perfringens

In questa lezione abbiamo considerato le caratteristiche di patogeni trasmessi con gli alimenti quali Bacillus cereus e Clostridium botulinum e Cl. perfringens e le loro relazioni con gli alimenti.

Alcuni punti di riflessione e studio sono i seguenti:

  • I tre microrganismi si caratterizzano per la loro produzione di spore che li rendono molto resistenti ai vari processi tecnologici.
  • Bacillus cereus produce due tipi di malattie, la sindrome diarroica e la sindrome emetica.
  • Le neurotossine botuliniche sono tra i più potenti veleni esistenti ed hanno un effetto paralizzante. Sono termolabili.
  • Le spore di Cl. botulinum sono molto resistenti al calore, richiedendo trattamenti di 121°C per 2,5 minuti per eliminarle.
  • Cl. perfringens causa tossinfezioni soprattutto attraverso alimenti non cotti a sufficienza, contaminati da spore termoresistenti e mantenuti alle temperature di crescita del microrganismo per lungo tempo.

Prossima lezione

Batteri patogeni trasmessi con gli alimenti: Brucella spp. ; Vibrio spp. ; Aeromonas spp. ; Campylobacter spp.

Nella prossima lezione tratteremo la biologia, l’ecologia, le attività metaboliche la sistematica e il comportamento di altri importanti batteri patogeni trasmessi con gli alimenti quali:

  • Brucella spp.
  • Vibrio spp.
  • Aeromonas spp.
  • Campylobacter spp.

Le lezioni del Corso

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