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Francesco Villani » 30.Conteggio in terreno liquido: tecnica MPN (Most Probable Number)


Metodo di stima del numero più probabile di microrganismi

Considerazioni

  • Procedura utilizzata per stimare la densità di una popolazione di microrganismi vitali in un dato campione.
  • E’ basato sulla probabilità di rilevare sviluppo microbico dopo coltura in terreno nutritivo liquido di diluizioni seriali di un campione.
  • Lo sviluppo microbico dopo incubazione dei brodi inoculati può essere valutato:
    • osservando l’eventuale intorbidamento della coltura;
    • valutando particolari attività metaboliche del microrganismo o popolazione microbica (produzione di gas, di acidi ecc.).
  • Il campione dovrebbe essere diluito in maniera tale che le diluizioni più spinte non presentino microrganismi (“diluizione all’estinzione”).
  • I migliori risultati si hanno quando tutti i tubi inoculati con le diluizioni più basse risultano positivi e tutti i tubi inoculati con le diluizioni più alte risultano negativi.

Basi teoriche

  • Allestiamo una serie di diluizioni decimali di un campione di acqua e inoculiamo 1 ml di ciascuna di esse in un tubo contenente un appropriato substrato nutritivo.
  • Teoricamente, se fosse presente almeno una cellula in ogni uno degli inoculi si dovrebbe osservare crescita visibile nel substrato corrispondente inoculato.
  • Ad esempio, se il brodo inoculato con la diluizione 10-4 mostra crescita mentre il brodo inoculato con la diluizione 10-5 non mostra crescita possiamo dedurre che il campione di acqua presentava più di 1×104 organismi per ml ma meno di 1×105 per ml.
  • Abbiamo già avuto modo di precisare che i batteri raramente sono distribuiti in maniera uniforme nel campione: per aumentare l’accuratezza statistica dell’MPN è necessario inoculare con ciascuna diluizione del campione più tubi di brodo nutritivo.

Lettura dei risultati

  • Le procedure standard per la determinazione dell’MPN usano un minimo di 3 diluizioni e 3, 5 o 10 tubi di brodo inoculati con ciascuna diluizione.
  • La variabilità statistica della distribuzione batterica è meglio stimata al crescere dei tubi inoculati o che sono praticamente inoculabili.
  • Per calcolare l’MPN per prima cosa individuiamo l’ultima diluizione che presenta tutti i tubi positivi (detta anche diluizione limite) e il numero di tubi positivi nelle due successive diluizioni.
  • La stima del MPN/ml o g di campione viene letta su apposite tavole MPN in base al numero di tubi positivi per ciascuna serie inoculata con una data diluizione.
  • Esistono tavole MPN per inoculi di 3, 5 e 10 tubi.

Procedura di determinazione del MPN

Materiale occorrente

  • Bilancia.
  • Apparecchiatura e sacchetti sterili per omogeneizzazione.
  • Attrezzi per la manipolazione del campione: coltelli, forbici, spatole, cucchiai, pinze, cilindri graduati, ecc. sterili.
  • Diluente sterile.
  • Pipette da 10, 1 e 0,1 ml.
  • Tubi contenenti l’adatto substrato nutritivo liquido.

Operazioni

  • Preparare la diluizione madre e le diluizioni seriali decimali del campione.
  • Seminare 1 ml di ogni diluizione in ciascuno di 3 tubi contenenti il substrato nutritivo.
  • Incubare per tempi e temperature appropriate.
  • Annotare il numero di tubi positivi per ciascuna diluizione.
  • Ricavare il MPN dalle apposite tavole.

Lettura del MPN sulle tavole statistiche

Si procede come segue:

  • Si annota per ciascuna diluizione il numero di provette positive (torbidità o produzione di un particolare metabolita che indica l’avvenuta crescita microbica), quindi si calcola il numero caratteristico che è costituito da 3 cifre, la prima delle quali è data dal numero di tubi che alla diluizione più spinta (detta anche diluizione limite) presentino la più elevata positività, la seconda e la terza cifra rappresentano, rispettivamente, il numero di tubi positivi nelle due successive diluizioni.
  • Sulle tavole, in corrispondenza del numero caratteristico determinato, si legge il MPN che moltiplicato per il reciproco della prima diluizione considerata (diluizione limite) indicherà il numero più probabile di microrganismi per g o ml di campione.

Tavola per la determinazione del MPN (3 tubi per diluizione)

Tavola per la determinazione del MPN (3 tubi per diluizione)

Tavola per la determinazione del MPN (3 tubi per diluizione)


Prossima lezione

Popolazioni microbiche specifiche degli alimenti: presupposti teorici, significato e metodi di ricerca e numerazione

Le lezioni del Corso

I materiali di supporto della lezione

Bell C., Neaves P., Williams A. P. (2005) Food Microbiology And Laboratory Practice. Blackwell Sciente, Uk.

Mossel D.A.A., Corry J.E.L., Struijk C.B., Baird R.M. (1995) Essentials Of The Microbiology Of Foods. A Text Book For Advanced Studies. John Wiley And Sons. Chichester, U.K

Roberts D., Hooper W., Greenwood M. (1995) Practical Food Microbiology. Phls, London.

Conteggio in terreno liquido: tecnica MPN (Most Probable Number)

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