Francesco Villani » 10.I microrganismi Probiotici. Le colture starter

Probiotica

Presupposti

All’inizio del 1900, il premio Nobel russo Elie Metchnikoff intuì che ceppi di lattobacilli presenti nello yogurt potevano essere in grado di svolgere un’azione positiva sulla microflora intestinale e dunque apportare benefici per la salute umana.

Metchnikoff fu il primo a suggerire l’ingestione di colture vive di batteri lattici il cui ruolo naturale era quello di prevenire i fenomeni putrefattivi nell’intestino.

Da allora molte ricerche sono state condotte in questo campo portando a quello che oggi noi conosciamo come “probiotica”.

Probiotico

Definizione

• Il termine probiotico deriva dal greco “pro” e “bios” e significa “a favore della vita“.
• Recentemente una Commissione di Esperti, ha definito con il termine probiotici:
• “microrganismi vivi che, ingeriti in un certo numero, esercitano degli effetti benefici sulla salute in aggiunta a quelli innati della nutrizione generale”La definizione non implica necessariamente la colonizzazione dell’intestino da parte dei probiotici.

Probiotico

Definizione

I PROBIOTICI sono dunque batteri che esercitano effetti positivi sulla salute umana.

E’ necessario che i microrganismi probiotici, quando assunti, siano:

• vivi e vitali
• non inattivati
• presenti in alto numero (anche se il loro numero specifico non è menzionato nella definizione, si ritiene che debbano essere ingerite almeno 109 UFC al giorno).

Inoltre è necessario che i benefici sulla salute siano dimostrati scientificamente da studi clinici sull’uomo.

Il microbiota intestinale

Ecosistema intestinale

Il concetto di probiotica si è sviluppato di pari passo con gli studi di microbiologia intestinale, che hanno evidenziato la presenza di un grande numero e varietà di microrganismi, dai quali si sono fatti emergere soprattutto lattobacilli e bifidobatteri probiotici dotati di attività fisiologiche e funzionali in grado di migliorare lo stato di salute umana.

La complessa popolazione microbica del TGI può essere considerata come un:

“ecosistema aperto comprendente un gruppo di popolazioni microbiche che coesistono in equilibrio in una definita regione spazio-temporale”.

I numeri

• Il numero di batteri presenti nel nostro organismo (10¹⁴) è dieci volte maggiore rispetto al numero di cellule umane presenti nei tessuti del nostro corpo (10¹³).
• E’ stimato che nel nostro intestino vivono più di 400 diverse specie e sottospecie di batteri appartenenti ad almeno 190 generi diversi.
• Ogni individuo, in genere, ha una sua microflora specifica dominata da 30-40 specie.

Definizioni

• I batteri che esercitano effetti positivi sulla salute umana sono denominati probiotici.
• Nell’intestino tali batteri si nutrono di sostanze denominate prebiotici che ne garantiscono la crescita.
• L’insieme dei batteri presenti nell’intestino umano costituisce quello che comunemente è chiamato il microbiota intestinale.

Le popolazioni microbiche dell’intestino

• La colonizzazione batterica inizia immediatamente dopo la nascita quando il neonato ha i primi contatti con l’ambiente esterno.
• Già dopo pochi giorni si assiste a modificazioni sia del numero che della composizione in specie dei batteri, i quali instaurano con l’organismo un importante equilibrio, fino a rappresentare circa il 40% del totale della massa intestinale, contribuendo per circa 1-1,5 Kg al nostro peso.
• Nel tratto intestinale possono essere presenti sia batteri utili che indesiderati che sono in continua competizione per mantenere la microflora intestinale in un equilibrio bilanciato.

Principali gruppi microbici dell’intestino

Principali gruppi microbici dell'intestino

Localizzazione delle popolazioni microbiche del colon

• Nel colon si assiste ad una esplosione del numero di batteri con alcuni gruppi che dominano a livelli di 1011-1012 UFC/g di feci risultando la parte del tratto gastro-intestinale più densamente popolata.
• Si tratta soprattutto di batteri anaerobi stretti quali: Bacteroides, Eubacterium, Bifidobacterium e Peptostreptococcus.
• Gruppi sub-dominanti appartengono ai generi Lattobacillus, Streptococcus e alla famiglia delle Enterobacteriaceae.

Studio delle popolazioni microbiche del colon

• Esistono molte difficoltà per lo studio dei microrganismi del colon, soprattutto legate all’ottenimento di campioni del contenuto intestinale.
• Inoltre lo studio della microflora fecale fornisce poche informazioni circa la microflora associata alla mucosa intestinale.
• In ogni modo, la microflora fecale sembra essere un buon indicatore della microflora del colon terminale, pur non riflettendo la microflora dell’intestino e soprattutto dell’intestino tenue.
• Molte specie batteriche non sono coltivabili (almeno il 12% delle cellule visibili al microscopio di un campione fecale) e quindi non sono evidenziate con le tecniche batteriologiche convenzionali, portando ad una sottostima del numero e specie di batteri presenti nell’intestino.

Studio delle popolazioni microbiche del colon

• L’impiego di tecniche di biologia molecolare consentono di superare parzialmente il problema legato alla non coltivabilità dei batteri. Ad esempio il DNA batterico può essere estratto direttamente dai campioni di feci, amplificando e sequenziando regioni specifiche, le cui sequenze nucleotidiche, confrontate con sequenze di riferimento consentono di stabilre l’identità dei batteri presenti nel campione fecale.
• In particolare il DNA che codifica per l’RNA ribosomale 16S (16S rDNA) contiene regioni conservate in tutte le specie batteriche intervallate da regioni (da V1 a V9) in cui le sequenze nucleotidiche sono variabili da una specie batterica all’altra.
• La comparazione delle similarità di sequenza del 16S rDNA possono essere quindi usate per l’identificazione di specie batteriche e dunque per l’analisi di comunità microbiche complesse.

Successione dei gruppi microbici (Figura 10a)

Schema della successione dei gruppi microbici dell'intestino

Fattori che influenzano la colonizzazione intestinale

1. Fattori mediati dall’ospite

• pH, secrezioni (come immunoglobuline, bile, sali, enzimi).
• Motilità (velocità, peristalsi).
• Fisiologia (compartimentalizzazione).
• Cellule esfoliate, mucina, essudati tessutali.

2. Fattori microbici

• Adesione.
• Mobilità.
• Flessibilità nutrizionale.
• Spore, capsule, enzimi, componenti antimicrobici.
• Tempo di generazione.

Fattori che influenzano la colonizzazione intestinale

3. Interazioni microbiche

• Sinergia
  • Cooperazione metabolica
  • Fattori di crescita ed escrezione di vitamine
  • Variazioni di Eh , pH, tensione di O₂
• Antagonismo/stimolazione
  • Acidi grassi a corta catena, ammine
  • Componenti antimicrobici, siderofori
  • Esigenze nutrizionali, etc

4. Dieta

• Composizione, fibre non digeribili, farmaci, etc.

Funzioni delle popolazioni microbiche dell’intestino

La microflora intestinale svolge numerose funzioni (metaboliche, trofiche e protettive) necessarie al mantenimento della salute dell’ospite; l’alterazione di una o più funzioni può determinare condizioni patologiche di varia entità.

Studi di sistemi gnotobiotici (gnotos: animali germ-free e animali che vivono in associazione con microrganismi noti) hanno fornito importanti informazioni sull’effetto del microbiota intestinale sulla fisiologia e patologia dell’ospite.

Alcune delle più importanti funzioni:

• Fermentazione di residui della dieta non digeribili
• Crescita e differenziazione di cellule epiteliali
• Sintesi di vitamine
• Assorbimento di ioni
• Prevenzione della colonizzazione da parte di batteri patogeni
• Stimolazione della risposta immunitaria

Funzioni delle popolazioni microbiche dell’intestino

Prevenzione della colonizzazione di patogeni

Diversi meccanismi:

• Competizione per nutrienti essenziali.
• Antagonismo nei confronti di altri batteri mediante la produzione di sostanze ad azione antimicrobica (batteriocine, perossidasi batteriche, etc.).
• Competizione per l’adesione a siti specifici delle cellule epiteliali dell’intestino. I batteri non patogeni che aderiscono sull’orletto a spazzola delle cellule epiteliali possono prevenire l’adesione e l’ingresso di patogeni enteroinvasivi nelle cellule epiteliali, esplicando così un effetto barriera.

Funzioni delle popolazioni microbiche dell’intestino

Stimolazione della risposta immunitaria

La microflora intestinale dirige la regolazione della risposta immunitaria promuovendo, mediante la produzione di fattori di crescita, citochine e molecole regolatrici lo sviluppo del tessuto linfoide associato alla mucosa intestinale (GALT: Gut Associated Lynphoid Tissue). Il GALT è considerato l’organo immunitario più grande del corpo umano. Esso contiene numerosi linfociti T, plasmacellule e accumuli di tessuto linfoide (placche di PEYER). Circa l’80% delle cellule produttrici di immunoglobuline sono presenti in questa struttura.

La protezione contro gli agenti infettivi avviene mediante la cattura da parte delle cellule M delle placche di Peyer dell’antigene che viene fagocitato dai macrofagi, che a loro volta presentano l’antigene ai Linfociti T. Questi secernono citochine che stimolano la trasformazione dei linfociti B a diventare cellule che producono IgA.

I batteri probiotici

Specie probiotiche

A dispetto della grande biodiversità dell’ecosistema intestinale, le attività probiotiche fino ad ora studiate sono legate ad un particolare ceppo di una definita specie batterica (ceppo-specifiche) appartenente principalmente ai generi:

• Lactobacillus (Lb. acidophilus La5, Lb. acidophilus NCFB1748, Lb. plantarum 299v, Lb. casei Shirota, Lb. casei 114-001 Immunitass, Lb. rhamnosus GG, Lb. fermentum KLD, Lb. paracasei F19, Lb. reuteri SD2112, Lb. johnsonii La1, Lb. salivarius UCC118).
• Bifidobacterium (Bf. lactis (bifidum) Bb12, Bf. longum, BB536, Bf. bifidum, Bf. infantis, Bf. breve, Bf. adolescentis, Bf. animalis).

Effetti benefici sulla salute

• Sebbene gli studi sulla probiotica necessitano di ulteriori e continui approfondimenti, è ormai ampiamente riconosciuto che l’assunzione di batteri probiotici possa essere utile nella cura e prevenzione di alcune malattie.
• I benefici sulla salute devono comunque essere dimostrati scientificamente da studi in vitro e da studi clinici sull’uomo.
• Le attività probiotiche fino ad ora studiate sono ceppo-specifiche e dunque i risultati degli studi non possono essere estrapolati: i ceppi probiotici sono unici e diversi tra loro.

Criteri di selezione dei probiotici

Specificità:

• Origine umana
• Accurata identificazione tassonomica
• Sicurezza: GRAS (Generally Recognized As Safe), non tossico, non patogeno

Competitività:

• Capacità di sopravvivere, proliferare e di svolgere attività metaboliche in vivo a livello del sito target
• Resistenza agli acidi
• Resistenza alla bile
• Capacità di adesione e potenziale capacità di colonizzazione (anche transitoria)

Criteri di selezione dei probiotici

Attività funzionali: Capacità di esplicare uno o più benefici sulla salute, clinicamente documentati:

• Prevenzione della colonizzazione da parte di batteri patogeni
• Stimolazione della risposta immunitaria
• Produzione di sostanze antimicrobiche (batteriocine, perossido d’idrogeno, acidi organici o altri composti inibitori)
• Attività antimutagene e anticancerogene
• Produzione di composti bioattivi (enzimi, peptidi).

Proprietà tecnologiche:

• Compatibilità con le tecnologie di produzione, di stoccaggio e di distribuzione
• Stabilità delle caratteristiche desiderate nel corso della preparazione delle colture e dello stoccaggio
• Caratteristiche di interesse tecnologico in riferimento allo specifico prodotto alimentare (o l’assenza di caratteristiche non-desiderabili)

Sicurezza dei batteri lattici probiotici

Gli esperti FAO/WHO hanno preparato delle linee guida che riportano i criteri e le metodologie per la valutazione dei probiotici definendo i dati e le informazioni necessarie per dimostrare la loro rivendicazione salutistica.

Al fine di garantirne la sicurezza, i probiotici dovrebbero essere saggiati almeno per le seguenti caratteristiche:

• Patterns di resistenza agli antibiotici
• Accertamento di alcune attività metaboliche (produzione di D-lattato; deconiugazione dei sali biliari)
• Accertamento di effetti collaterali negli studi su umani
• Sorveglianza epidemiologica dopo la commercializzazione
• Saggiare per la produzione di tossine i ceppi appartenenti ad una specie conosciuta come produttrice di tossine
• Saggiare l’attività emolitica dei ceppi appartenenti ad una specie conosciuta come emolitica

Prebiotici e simbiotici

Prebiotici

Ingredienti alimentari, non digeribili da parte dell’uomo, in grado di esercitare un effetto positivo sulla salute dell’ospite attraverso la stimolazione selettiva della crescita e/o dell’attività di un limitato numero di batteri nel colon, in particular modo di lattobacilli e/o bifidobatteri. Obiettivo principale dei prebiotici è dunque quello di “modulare il livello e le attività di differenti gruppi di microrganismi endogeni intestinali”

Alimenti simbiotici

L’alimento simbiotico è costituito dall’associazione di un alimento probiotico con alimenti prebiotici in rapporti tali da rispondere al razionale di alimento funzionale.

Attualmente sono prodotti diversi alimenti simbiotici. In particolare yogurt e altri derivati del latte e le formule lattee di proseguimento, arricchite di Bifidobatteri e lattobacilli probiotici e FOS.

Le colture starter

Premessa

• L’industria alimentare, per garantire la qualità dei suoi prodotti cerca di ridurre la variabilità e di migliorare le caratteristiche organolettiche del prodotto finito. Poiché attraverso le fermentazioni spontanee, la costanza di qualità non sempre è raggiungibile, negli ultimi anni si è accresciuto l’utilizzo di colture starter, le quali assicurano la standardizzazione delle caratteristiche organolettiche, la riduzione del tempo di trasformazione, contribuiscono ad un miglioramento della sicurezza igienica e garantiscono costanti livelli di “shelf-life”.
• L’impiego delle colture starter deriva dal principio di isolare e identificare i germi responsabili delle caratteristiche organolettiche desiderate ed aggiungerli alla materia prima allo scopo di rafforzarle o riprodurle.

Le colture starter

Definizione

Sono preparazioni che contengono microrganismi vivi e vitali che sono impiegate con l’obiettivo di utilizzare il metabolismo microbico per il raggiungimento di specifici obiettivi tecnologici.

Classificazione

• Colture starter con ceppi misti: sono note anche come colture a composizione indefinita. Sono costituite da substrati fermentati risultanti da lavorazioni precedenti.
• Colture starter a singolo ceppo (una specie)
• Colture starter a ceppi multipli (più ceppi di una o più specie)

Selezione e formulazione

• Le colture starter sono state introdotte in alcuni settori dell’industria alimentare per iniziare la fermentazione e assicurare l’esito tecnologico del processo produttivo.
• La selezione dei ceppi e la formulazione delle colture starter pertanto è stata per lungo tempo basata soprattutto sulla capacità dei ceppi microbici di svolgere i processi biochimici richiesti dalle varie tecnologie di trasformazione.
• Lo sviluppo delle biotecnologie e le migliori conoscenze sul metabolismo dei microrganismi coinvolti nei processi fermentativi hanno consentito di evidenziare molti attributi fisiologici dei ceppi usati come colture starter che possono contribuire al controllo di microrganismi indesiderati, sia alterativi che patogeni, così come assicurare il conseguimento degli obiettivi industriali.

Le colture protettive e i meccanismi di antagonismo microbico

Definizione

Coltura starter o non starter in grado di esercitare azioni antimicrobiche nei confronti di microrganismi indesiderati.

In realtà potrebbe trattarsi della stessa coltura applicata per scopi diversi in condizioni diverse.

Naturalmente per una coltura starter le attività metaboliche di interesse tecnologico (capacità acidificanti, proteolitiche, aromatizzanti, addensanti ecc.) hanno un’importanza principale, mentre le azioni antimicrobiche potrebbero rappresentare un effetto secondario; per una coltura protettiva gli obiettivi funzionali sono l’inverso.

Le batteriocine

Tra le diverse sostanze ad azione antimicrobica prodotte dai batteri lattici, le batteriocine occupano un posto di rilievo.

Definizione

Proteine biologicamente attive sintetizzate ribosomalmente o complessi proteici in grado di esercitare attività battericida nei confronti di altre specie batteriche, ma non sul microrganismo produttore.

La batteriocina più nota: la Nisina

• Prodotta da ceppi di Lactococcus lactis subsp. lactis
• Attiva contro altri batteri lattici e patogeni come Listeria monocytogenes e Clostridium botulinum
• Peptide contenente 34 aminoacidi (3354 Da)
• L’uso della Nisina come additivo alimentare è consentito in circa 50 paesi per aumentare i tempi di conservazione di alimenti come latte e derivati, conserve vegetali, prodotti carnei sia freschi che fermentati e prodotti ittici

Le colture starter e/o protettive

Caratteristiche

Sicurezza:

• Gli organismi usati non devono essere dotati di nessuna attività patogena o tossica.

Efficacia tecnologica:

• Gli organismi usati devono essere in grado di competere con la microflora autoctona e dominare il processo tecnologico.
• Gli organismi devono essere in grado di svolgere le attività metaboliche per le quali sono stati selezionati nelle condizioni di processo.

Aspetti economici:

• La propagazione degli organismi starter deve essere economicamente conveniente.
• La coltura starter deve poter essere conservata allo stato congelato o liofilizzato senza perdita delle peculiarità metaboliche.
• Le proprietà metaboliche devono essere stabili per molti mesi nelle condizioni di stoccaggio.
• La loro manipolazione e impiego deve essere semplice.

Tipologie di starter

Starter naturali:

• Latto-innesti
• Siero-innesti

Starter selezionati:

• Liquidi
• In polvere (liofilizzati o essiccati)
• Congelati

Modalità di impiego degli starter selezionati:

• Inoculo diretto in caldaia
• Propagazione progressiva

Considerazioni conclusive

Batteri probiotici e colture starter

In questa lezione abbiamo preso in considerazione le principali caratteristiche dei batteri probiotici e delle colture starter e protettive.

Alcuni punti di riflessione e studio sono i seguenti:

• I batteri probiotici esercitano effetti benefici sulla salute.
• Il concetto di probiotica si è sviluppato di pari passo con gli studi delle popolazioni microbiche intestinali che hanno evidenziato la presenza di un grande numero e varietà di microrganismi, alcuni dotati di attività fisiologiche e funzionali in grado di migliorare lo stato di salute umana.
• Le colture starter e/o protettive sono preparazioni che contengono microrganismi vivi e vitali che sono impiegate con l’obiettivo di utilizzare il metabolismo microbico per assicurare il conseguimento di specifici obiettivi industriali e contribuire al controllo di microrganismi indesiderati, sia alterativi che patogeni.

Prossima lezione

I microrganismi indicatori della qualità e sicurezza microbiologica degli alimenti

La sicurezza e la qualità microbiologica di un alimento è determinata dall’assenza di microrganismi patogeni e/o delle loro tossine e dal livello di microrganismi alterativi.

Per accertare la qualità microbiologica e la sicurezza di un alimento si fa ricorso alla ricerca di organismi, detti marker, in grado di indicare una situazione potenzialmente pericolosa.

Nella prossima lezione tratteremo l’ecologia, la fisiologia e la tassonomia delle principali specie di batteri lattici coinvolte nei processi di produzione degli alimenti.

In particolare tratteremo i seguenti argomenti:

• La qualità microbiologica degli alimenti
• Gli organismi indicatori della qualità e sicurezza microbiologica degli alimenti