Francesco Villani » 22.Microbiologia di prodotti alimentari: Vino, Birra

Microbiologia del vino

Caratteristiche

• Il vino è ottenuto dalla fermentazione alcolica del succo zuccherino dell’uva (mosto) da parte dei lieviti.
• L’ecologia microbica del processo va oltre la semplice fermentazione alcolica dello zucchero, coinvolgendo interazioni complesse tra lieviti, funghi filamentosi, batteri lattici, batteri acetici e altri gruppi batterici.
• Esistono al mondo circa 400 varietà di uva da vino molte delle quali con numerosi cloni.
• Le principali varietà di uve utilizzate per la produzione di vino rosso sono Merlot, Cabernet, Sauvignon, Barbera, Shiraz, Pinot noir, Cabernet franc, mentre le varietà per il vino bianco sono Riesling, Traminer, Müller-turghau, Chardonnay, Mèmillon, Sauvignon blanc.
• Dunque è possibile ottenere infinite combinazioni organolettiche del prodotto.

Schema di vinificazione in rosso

Schema di vinificazione in rosso

Schema di vinificazione in bianco

Schema di vinificazione in bianco

La microflora dell’uva

Lieviti, muffe, batteri acetici e batteri lattici, che trovano la loro origine nel terreno.

• Lieviti: sull’uva integra a livelli di 10³-10⁵ UFC/g. Hanseniaspora uvarum (Kloeckera apiculata), Hanseniaspora guilliermondii (Kloeckera apis), Candida stellata, Metschnikowia pulcherrima, Cryptococcus, Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces cerevisiae. Quest’ultima specie è presente con <50 UFC/g. Sull’uva danneggiata i microrganismi giungono a livello di 10⁶ – 10⁸ UFC/g registrandosi un aumento di muffe e batteri acetici.
• Batteri lattici: soprattutto specie di Lactobacillus, Leuconostoc e Pediococcus.
• Batteri acetici: Gluconobacter oxydans, Acetobacter aceti e Acetobacter pasteurianus.
• Muffe: Botrytis cinerea, specie di Penicillium, Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Alternaria e Cladosporium.

Il mosto d’uva

• Acqua: 70-85%
• Zuccheri: glucosio, detto anche “zucchero d’uva”, maggiormente presente in uve parzialmente immature e fruttosio. La percentuale di zuccheri presenti nel mosto determinerà il titolo alcolometrico del vino secondo l’assunto:
  • percentuale di zucchero x 0,6 = volume alcolico% (da 1g di zucchero si ottengono 0,6 ml di alcol)
• Acidi organici: acido tartarico (gusto duro), il più caratteristico delle uve; acido malico (gusto aspro), più presente nelle zone a clima freddo; acido citrico (gusto fresco) meno presente degli altri.
• L’ “acidità totale” di un mosto è determinata dalla somma di:
  • acidi “fissi” tartarico, malico, citrico, altri acidi minori.
  • acidi “volatili” acido acetico.

Se l’acidità è adeguata il vino risulta serbevole e fresco, se è troppo bassa risulta piatto, se è alta risulta duro.

L’acidità totale si esprime in gr/l di acido tartarico: da 4‰ a 9 ‰.

Il mosto d’uva

• Polifenoli (tannini e coloranti): sostanze che determinano il colore ed il sapore del vino. Si classificano in:
  • antociani (coloranti), che donano il colore rosso ai vini giovani;
  • flavoni (coloranti), importanti per il colore dei vini bianchi;
  • leucoantociani e catechine (tannini) che oltre al colore dei vini bianchi determinano il gusto astringente.
• Composti azotati: polipeptidi, aminoacidi e ammoniaca;
• Sostanze pectiche (pectine, gomme, mucillagini): aumentano dopo la maturazione e diminuiscono dopo la fermentazione; gomme e mucillagini possono essere responsabili di intorbidamento;
• Sostanze odorose (terpèni): sono presenti nelle bucce in percentuali molto variabili nelle diverse uve;
• Elementi minerali: fosfati, solfati, sali di potassio, magnesio, calcio, ferro. Nella loro globalità definiti “ceneri” determinano la limpidezza e la sapidità del vino.

Lieviti vinari – Famiglia Schizosaccharomycetaceae

Genere Schizosaccharomyces

• Cellule globose o cilindriche; si moltiplicano per scissione. Sono normali componenti della microflora delle uve di zone temperate; hanno una vigorosa attività fermentativa e sono i principali agenti della fermentazione malo-alcolica.
• Principali specie:
  • S. pombe
  • S. japonicum
  • S. octosporus

Lieviti vinari – Famiglia Schizosaccharomycoidaceae

Cellule apiculate (forma di limone); moltiplicazione per gemmazione. Strettamente collegati con il genere Kloeckera di cui rappresentano la forma perfetta (sporigena). Spesso dominanti nelle zone a clima temperato-caldo. Da un punto di vista enologico sono indesiderati in quanto responsabili dell’alta acidità volatile dei vini dell’Italia meridionale.

• Genere Hanseniaspora: H. uvarum (Kloeckera apiculata), H. guilliermondii (Kloeckera apis).
• Genere Saccharomycoides: S. ludwigii, è il lievito con la più alta resistenza all’anidride solforosa, risultando il principale responsabile della fermentazione dei mosti muti.

Lieviti vinari – Famiglia Saccharomycetaceae

Comprende la maggior parte dei lieviti ascosporigeni.

• Genere Dekkera. Forma perfetta del genere Brettanomyces. Presenti sia nei vini che nei mosti. Il ruolo è ancora incerto. Produce elevate quantità di acido acetico.
• Genere Pichia. Privi di attività fermentativa. Sviluppano alla superficie dei liquidi e sono agenti della fioretta dei vini.
• Genere Torulaspora. T. delbrueckii (corrisponde alle vecchie specie Torulaspora rosei e Saccharomyces rosei). Presenta ottime caratteristiche enologiche: forte vigore fermentativo, buon potere alcoligeno e buona resistenza agli antisettici. E’ uno dei principali agenti della fermentazione vinaria, anche se non riesce a prendere il sopravvento su Saccharomyces cerevisiae.
• Genere Zygosaccharomyces. Buona attività fermentativa. Sono presenti nei mosti fermentati spontaneamente.

Evoluzione dei lieviti durante la fermentazione

• Nel mosto, già dopo poche ore dalla pigiatura, si creano condizioni di anaerobiosi tali da impedire lo sviluppo di microrganismi dotati di metabolismo ossidativo, quali i batteri acetici e muffe, favorendo quello dei lieviti che prendono il sopravvento.
• Nelle prime fasi della fermentazione domina il gruppo dei lieviti apiculati del genere Kloeckera che nei climi caldi è affiancato dalla sua forma perfetta Hanseniaspora guilliermondi.
• Quando la concentrazione di alcool è prossima al 5% i lieviti apiculati arrestano la loro attività e prende il sopravvento Saccharomyces cerevisiae che diventa padrone del processo portandolo a termine.

Interventi sulla fermentazione dei mosti

• La fermentazione spontanea dei mosti da parte dei numerosi lieviti che intervengono nel processo è una pratica oramai in disuso.
• Oggi vengono praticati numerosi interventi per evitare lo sviluppo dei “lieviti selvaggi” (apiculati come Kloeckera e Hanseniaspora ai quali si attribuiscono i difetti di dare origine a fermentazioni poco pulite e incomplete) a favore dei lieviti ellittici della specie Saccharomyces cerevisiae, mediante fermentazioni guidate:
  • Impiego di lieviti selezionati.
  • Fermentazioni scalari.
  • L’impiego dell’anidride solforosa.

Fermentazioni scalari

In linea di principio le fermentazioni naturali sono delle fermentazioni scalari: successione di lieviti apiculati con lieviti ellittici.

Le fermentazioni scalari possono essere condotte inoculando in successione il mosto con lieviti selezionati.

• All’inizio il mosto è inoculato con:
  • Zygosaccharomyces veronae
  • Torulaspora delbrueckii
  • Kloeckera apiculata
  • Candida stellata
• Dopo 4-5 giorni si procede all’inoculo con:
  • S. cerevisiae

Impiego di anidride solforosa

Aggiunta ai mosti subito dopo la pigiatura in quantità comprese tra 50 e 150 mg/litro.

Svolge le seguenti azioni:

• Ha azione selettiva sui lieviti, bloccando l’attività degli apiculati.
• Inibisce lo sviluppo dei batteri lattici.
• Inibisce lo sviluppo dei batteri acetici.
• Stabilizza i vini sotto l’aspetto biochimico impedendone le ossidazioni.

La sensibilità dei lieviti all’anidride solforosa varia con la specie e con il ceppo:

• Gli apiculati sono inibiti completamente a concentrazioni inferiori a 50 mg/l.
• Nell’ambito di S. cerevisiae vi sono ceppi che si sviluppano anche a concentrazioni > di 150 mg/l, altri sono inibiti anche da 30-40 mg/l.

Componenti importanti dei vini

Alcol

• E’ uno dei componenti più importanti legato al quadro organolettico del prodotto.
• E’ prodotto dai lieviti mediante la fermentazione del glucosio ad acido piruvico che è decarbossilato (piruvato decarbossilasi) ad acetaldeide e CO₂. L’acetaldeide a sua volta è ridotta per intervento dell’enzima alcol deidrogenasi ad etanolo.
• Agisce sulla indispensabile solubilità di quei composti (polifenoli, tannini ecc.) che sono alla base del “bouquet” di ogni tipo di vino.
• Il suo quantitativo (° alcolico) è soggetto a precise e rigorose norme nazionali e comunitarie: % vol (alcol in ml/c.c.) contenuti in 100 ml di vino.
• Permette di evidenziare la genuinità del prodotto: derivando dalla fermentazione degli zuccheri del succo d’uva (glucosio-fruttosio), tramite analisi particolari (risonanza magnetica) si possono evidenziare frodi quali l’aggiunta di saccarosio.

Componenti importanti dei vini

Polifenoli

• I polifenoli costituiscono la componente colorata del vino.
• Sono contenuti nella buccia dell’acino d’uva. Trasmettono al vino, oltre il colore, il carattere di astringenza e di amaro. La maggiore o minore presenza nel vino, dipende dal tempo di contatto del mosto con le bucce (aumentano con l’invecchiamento del vino).
• Tra i più importanti composti del vino biologicamente attivi insieme ai loro polimeri, cioè i tannini contenuti principalmente nei semi.
• In base al contenuto dei polifenoli i vini sono classificati in bianchi, rosati e rossi di diversa intensità.
• La variazione delle sostanze fenoliche nel vino, sia in quantità che nel tipo, dipende:
  • dalla varietà di uva (vitigno);
  • dalla permanenza del vino a contatto con il legno di rovere durante l’invecchiamento (arricchimento in acidi fenolici quali: acido gallico, siringico e vanilico).

La fermentazione malo-lattica

• Reazione di decarbossilazione dell’acido L-malico ad acido L-lattico.
• Comincia 2-3 settimane dopo quella alcolica e dura 2-4 settimane.
• E’ operata da batteri lattici: Oenococcus oeni (utilizzato come starter), Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus fructivorans, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus damnosus.

Effetti della fermentazione malo-lattica:

• decremento dell’acidità fissa;
• incremento del pH di 0,3-0,5 unità;
• vini più amabili.

Alcuni difetti del sapore e dell’odore dei vini

• Odore di zolfo. Imputabile a residui di trattamenti antioidici all’uva o da trattamenti antifungini delle botti.
• Odore e gusto di muffa. Difetto imputabile a Botrytis cinerea (muffa grigia).
• Gusto di tappo. Provocato da miceli (funghi) insediatisi nel tessuto del sughero.
• Casse ossidasica (Annerimento all’aria). Alterazione dovuta alla presenza di ossidasi nel vino, che ossidano le sostanze fenoliche. Si ha soprattutto quando si vinificano uve guaste, marcite, peronosporate.
  • Vini rossi: rottura di colore con imbrunimento, intorbidamento e deposizione di sostanza colorante; odore marsaleggiante.
  • Vini bianchi: scurimento e formazione di un velo iridescente, odore marsaleggiante.
• Casse rameosa (Vino bianco che arrossa all’aria).
• Casse ferrica (Vino che annerisce per il ferro).

Microbiologia della birra

Caratteristiche

La birra è il prodotto ottenuto dalla fermentazione alcolica, con ceppi di Saccharomyces carlsbergensis o di Saccharomyces cerevisiae, dei mosti preparati con malto d’orzo torrefatto, con acqua ed amaricati con luppolo.

Classificazione italiana delle birre

• Birra analcolica: 3-8 gradi saccarometrici (1,2% titolo alcolometrico volumico, vol).
• Birra light: 5-10,5 gradi saccarometrici (1,2-3,5% vol).
• Birra normale: 11-13 gradi saccarometrici (3,6-4,3% vol).
• Birra speciale: 13-15 gradi saccarometrici (4,3-5% vol).
• Birra doppio malto: più di 15 gradi saccarometrici (oltre 5% vol).

Fasi di preparazione della birra

1. Preparazione del malto, a partire da orzo o altri cereali.
2. Ammostatura, in cui il malto si trasforma in mosto, grazie alla trasformazione dell’amido in zuccheri fermentescibili.
3. Luppolatura e cottura del mosto.
4. Raffreddamento alla temperatura ottimale di fermentazione.
5. Aggiunta del lievito.
6. Fermentazione principale e secondaria.
7. Filtrazione e confezionamento.

1) Preparazione del malto

Si utilizza orzo distico (a due file) estivo (Hordeum distichum).

• Pulitura e vagliatura
  • Per eliminare gli eventuali corpi estranei.
• Macerazione o ammollamento
  • Macerazione per due-quattro giorni (in genere fino ad un contenuto idrico della cariosside del 40%) in recipienti colmi d’acqua a 10-15°C, allo scopo di favorirne la germinazione.
• Germinazione o tallitura
  • Stratificazione dell’orzo ammollato (40-90 cm) su un pavimento o in germinatoi a temperature di 15-18° C continuamente rivoltate per evitare accumulo di calore.
  • Fino a quando le radichette avranno raggiunto la lunghezza di circa una volta e mezza di quella della cariosside (variabile da 8 a 12 giorni). La comparsa e lo sviluppo della radichetta caratterizzano la germinazione.

1) Preparazione del malto

• Scopo della germinazione: arricchire la cariosside di una serie di enzimi amilolitici (diastasi) indispensabili alle trasformazioni che devono avere luogo nel corso del maltaggio e poi durante l’ammostatura. Con la germinazione il chicco, che è duro e corneo all’inizio, diventa tenero e friabile costituendo il MALTO VERDE. Le principali trasformazioni alle quali è soggetto l’orzo nel corso del maltaggio riguardano le proteine e l’amido.
• Proteine solubili (albumina e globulina): gli enzimi proteolitici solubilizzano l’albume del corpo farinoso trasformandolo in peptoni e aminoacidi.
• Amido: è modificato solo in misura minima durante la germinazione. Gli enzimi emicellulosolitici liberano le amilasi che passano dallo scutello al corpo farinoso e dopo l’attivazione da parte di enzimi proteolitici iniziano ad idrolizzare l’amido in destrine (miscele di frammenti di polisaccaridi) e maltosio.

2) Preparazione del mosto

Il malto essiccato viene prima macinato e quindi miscelato con acqua e cotto al fine di estrarre tutte le sostanze solubili e solubilizzabili attraverso l’azione delle diastasi e di altri enzimi.

• Ammostatura per infusione. Si impasta il malto con acqua a 40°C, quindi si aggiunge acqua a 80°C fino a portare la massa a 63-65°C in circa mezz’ora. La massa viene tenuta sotto agitazione per 1 ora a questa temperatura.
• Ammostatura per decozione. Il malto si impasta con acqua fredda, quindi si trasfeisce circa la metà dell’impasto di mosto in un tino di saccarificazione dove viene riscaldato fino all’ebollizione e quindi ritrasferito nel primo tino. Tale operazione è ripetuta più volte fino a che la massa arriva ad una temperatura di circa 75-80°C.

2) Preparazione del mosto

• Nella fase di ammostatura si ha la demolizione dell’amido in amilosio e amilopectina.
• L’amilosio viene idrolizzato in maltosio fermentescibile mentre l’amilopectina in destrine non fermentescibili.
• Alla fine dell’ammostatura tutto l’amido è trasformato per il 60% in amilosio e per il 40% in destrine (saccarificazione).
• La temperatura ottimale delle amilasi è da 72 a 78°C.
• Si formano inoltre peptidi e aminoacidi che favoriscono la formazione della schiuma e la crescita dei lieviti.
• Il mosto è quindi scaricato nei tini di chiarificazione, dove vengono separate le trebbie.
• Al termine di questa operazione il mosto limpido è trasferito nei tini di cottura e di luppolatura.

3) Luppolatura e cottura del mosto

• Luppolatura: aggiunta di infiorescenze femminili della pianta rampicante Humulus lupulus che grazie al loro contenuto di umulene, α-umulone, β-luppulone, oli essenziali e tannini, conferiscono alla birra aromi particolari e il tipico sapore amaro.
  • Quantità: 150-400 g/hl birre chiare. 100-200 g/hl birre scure.
• Cottura del mosto: il mosto viene riscaldato all’ebollizione per 1-2 ore. Con questo trattamento si ha: inattivazione degli enzimi; solubilizzazione delle sostanze del luppolo; coagulazione delle albumine; concentrazione del mosto; eliminazione microrganismi.
  • Segue la separazione delle sostanze proteico-tanniche precipitate con l’ebollizione e le trebbie del luppolo.
  • Quindi il mosto viene trasferito nelle vasche di raffreddamento.

4) Raffreddamento

Il mosto viene raffreddato a temperature di:

• 12-20°C per birre a fermentazione alta (TIPO ALE);
• 2-9°C per birre a fermentazione bassa (TIPO LAGER).

5) Lieviti per la fermentazione

Colture pure di ceppi che sono selezionati sulla base dei loro caratteri fisiologici e tecnologici: Potere fermentativo a diverse temperature:

• Formazione di schiuma.
• Potere flocculante.
• Produzione di composti aromatici.

Lieviti bassi

Ceppi di Saccharomyces carlsbergensis per la produzione di birre a fermentazione bassa. Hanno un buon potere fermentativo a 5-10°C.

Sono caratterizzati da cellule isolate che tendono a formare fiocchi per cui al termine della fermentazione si depositano sul fondo dei tini formando solo un velo impercettibile sulla superficie del liquido.

5) Lieviti per la fermentazione

Lieviti alti

Ceppi di Saccharomyces cerevisiae per la produzione di birre a fermentazione alta.

Le cellule durante la gemmazione restano attaccate alla cellula madre formando lunghe ramificazioni (pseudomicelio). Sono finemente distribuiti nel mosto e durante la fermentazione tendono a salire in superficie dove formano uno strato compatto detto coperchio.

Hanno un potere fermentativo ottimale a temperature comprese fra 15 e 25°C.

6) Il processo di fermentazione

I lieviti sono aggiunti al mosto fino a raggiungere concentrazioni finali di 10⁷ cellule/ml.

• Fermentazione tumultuosa: si ha prevalentemente produzione di alcol e anidride carbonica.
• Fermentazione secondaria o maturazione: si completa la fermentazione degli zuccheri fermentescibili e la formazione di altri composti che caratterizzano la birra.

6) Il processo di fermentazione

Birre di fermentazione bassa

• Fermentazione primaria: avviene in serbatoi chiusi alla temperatura di 8-10°C e dura da 6 a 10 giorni. Il lievito si moltiplica consumando ossigeno quindi inizia a fermentare con produzione di CO₂ che determina la formazione di schiuma. Con il rallentamento della fermentazione la schiuma si trasforma in uno strato spesso e colorato in bruno mentre i lieviti flocculano depositandosi sul fondo.
• Fermentazione secondaria: la birra é travasata in altri serbatoi dove è lasciata maturare a temperature di 5°C prima e a 0 o -1°C poi, per tempi variabili da qualche settimana fino a qualche mese.

In questa fase, oltre a completarsi la fermentazione, sono prodotti sostanze aromatiche quali il diacetile, l’acetoino e il 2,3-butandiolo.

6) Il processo di fermentazione

Birre di fermentazione alta

• Fermentazione primaria: a temperatura di 16-20°C e dura 2-3 giorni.
• Fermentazione secondaria: può mancare del tutto o essere piuttosto breve (7-20 giorni). L’andamento della fermentazione viene espresso dal grado di attenuazione che rappresenta la diminuzione di densità del mosto per la scomparsa dello zucchero e la produzione di alcol e anidride carbonica.

7) Chiarificazione e confezionamento

Prima di essere confezionata in bottiglie o in lattine, la birra viene chiarificata per filtrazione o centrifugazione per eliminare tutti i residui.

Per una maggiore stabilità microbica, le bottiglie o le lattine di birra vengono pastorizzate a 70°C per 30-60 secondi.

Considerazioni conclusive

Microbiologia del vino e della birra

In questa lezione abbiamo considerato gli aspetti microbiologici del vino e della birra.

Alcuni punti di riflessione e studio sono i seguenti:

• L’ecologia microbica del processo di vinificazione va oltre la semplice fermentazione alcolica dello zucchero, coinvolgendo interazioni complesse tra lieviti, funghi filamentosi, batteri lattici, batteri acetici e altri gruppi batterici.
• La birra è il prodotto ottenuto dalla fermentazione alcolica, con ceppi di Saccharomyces carlsbergensis o di Saccharomyces cerevisiae, dei mosti preparati con malto d’orzo torrefatto, con acqua ed amaricati con luppolo.
• Il processo di fermentazione operato dai lieviti avviene i due momenti distinti, nel primo dei quali si ha prevalentemente produzione di alcol e anidride carbonica, nel secondo si ha la maturazione.

Prossima lezione

Microbiologia di prodotti alimentari: uova e prodotti a base d’uova; acque potabili

Nella prossima lezione tratteremo gli aspetti microbiologici della produzione e conservazione di uova e prodotti a base d’uova. Inoltre prenderemo in esame la potabilità microbiologica delle acque.