Francesco Villani » 28.Preparazione del campione per l'analisi e numerazione dei microrganismi

Numerazione dei microrganismi negli alimenti – Metodi

Diversi sono i metodi utilizzati per determinare il numero di microrganismi presenti in un campione di alimento.

Quelli maggiormente utilizzati sono:

1. Conteggio standard di cellule vitali su piastra (Standard Plate Counts, SPC).
2. Metodo del numero più probabile di microrganismi (Most probable number, MPN) per la determinazione statistica delle cellule vitali.
3. Conteggio diretto microscopico, per cellule vitali e non.
4. Tecniche che sfruttano la riduzione di coloranti per stimare il numero di microrganismi che possiedono capacità riduttive.

Numerazione dei microrganismi negli alimenti – Metodi

Tutti i metodi di numerazioni presentano una serie di limitazioni, per cui i risultati vanno interpretati tenendo conto di una serie di fattori, quali:

1. Metodo di campionamento e sottocampionamento.
2. Distribuzione e dinamicità dei microrganismi nel campione.
3. Tipo e natura dell’alimento e della microflora in esso presumibilmente presente.
4. Storia analitica dell’alimento.
5. Metodo di analisi, tempo, temperatura e atmosfera di incubazione, composizione, pH, a_w ed Eh del diluente e del substrato utilizzato.

Fasi per il conteggio standard in piastra

I metodi colturali di numerazione dei microrganismi prevedono una serie di fasi che vanno seguite nell’ordine predefinito, al fine di ridurre al minimo le limitazioni descritte precedentemente. Le fasi sono:

1. Preparazione del campione e delle diluizioni seriali (scelta del diluente).
2. Semina in o su terreno nutritivo agarizzato (scelta del substrato adatto).
3. Incubazione alla temperatura e per tempi appropriati alla microflora da numerare.
4. Conteggio delle colonie e interpretazione dei risultati.

Preparazione del campione per l’analisi

Considerazioni

• Le cellule microbiche imbrigliate nelle matrici alimentari, per essere contate, devono essere trasferite nell’adatto substrato nutritivo.
• I campioni alimentari liquidi possono essere trasferiti in piastra tal quali (eventualmente previa diluizione).
• I campioni solidi, invece, prima di essere analizzati, vanno omogeneizzati in un adatto diluente, al fine di disperdere i microrganismi nella fase liquida che può essere facilmente manipolata per l’analisi.
• Iniziare le operazioni il più presto possibile dopo il prelievo del campione.
• I campioni congelati vanno fatti scongelare nel loro contenitore di origine mantenendoli per circa 18 ore in frigorifero alla temperatura di +2/+5°C.
• Conservare in condizioni refrigerate la parte in eccesso del campione avanzata dall’analisi per eventuali ulteriori indagini.

Procedura di preparazione della diluizione madre

Materiale occorrente:

• Bilancia.
• Apparecchiatura e sacchetti di plastica sterili per omogeneizzazione.
• Attrezzi per la manipolazione del campione: coltelli, forbici, spatole, cucchiai, pinze, cilindri graduati, pipette, ecc. sterili.
• Diluente sterile.

1. Campione solido: pesare esattamente una data quantità (n) di campione alimentare (da 10 a 25 g) in un sacchetto di plastica sterile per omogeneizzazione.
2. Aggiungere un adatto diluente in quantità nove volte superiore alla quantità di alimento (9xn).
3. Omogeneizzare (omogeneizzatore peristaltico a pale).

In questo modo è stata realizzata una diluizione 1/10 (o 10-1) del campione. Tale diluizione è detta anche diluizione madre.

Considerazioni sui diluenti per la preparazione del campione

• Il diluente utilizzato deve avere una temperatura prossima a quella del campione, per evitare danni termici ai microrganismi.
• La prima diluizione può essere lasciata a riposo, per favorire la decantazione di particelle grossolane e la dispersione di microrganismi nel diluente. In ogni modo l’intervallo di tempo tra la preparazione della prima diluizione e quelle successive non dovrebbe mai superare i 15 minuti mentre la semina in piastra delle diluizioni preparate deve avvenire al massimo entro 20-30 minuti dalla preparazione della diluizione iniziale.

Prossima lezione

Preparazione delle diluizioni decimali seriali; Tecniche di semina delle piastre; Condizioni di incubazione delle piastre; Numerazione delle colonie in piastra; Considerazioni sui limiti di rilevamento del conteggio in piastra.