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Preparazione delle diluizioni seriali

Teoria delle diluizioni decimali

• In microbiologia quantitativa si mira a determinare il numero di microrganismi o, più precisamente, il numero di Unità Formanti Colonie (UFC) per ml o g in un determinato campione.
  • Esempio 1: se noi seminiamo su un adatto substrato 1 ml di latte e troviamo, dopo incubazione delle piastre, che si sono sviluppate 15 colonie, siamo in grado di concludere che il campione di latte conteneva 15 UFC/ml.
• Più realisticamente, la concentrazione di microrganismi in un campione di latte è considerevolmente più elevata, per cui il conteggio delle colonie su una piastra inoculata con 1 ml del campione potrebbe risultare impossibile.
  • Esempio 2: supponiamo che il nostro campione di latte presenti una concentrazione di microrganismi pari a 100.000 UFC/ml. In questo caso ci aspettiamo di avere una piastra con colonie contabili (100 UFC/ml) solo seminando 0,001 ml di latte.

Teoria delle diluizioni decimali

Come appare evidente la procedura descritta nell’esempio 2 è poco praticabile a causa di:

1. difficoltà, con gli attrezzi disponibili, di trasferire in piastra inoculi così piccoli;
2. inoculi così piccoli rendono il campione poco rappresentativo.

La stessa procedura è resa praticabile applicando la teoria delle diluizioni:

• Realizzando delle diluizioni decimali seriali del campione di latte (ad es. 1ml di campione in 9ml di diluente sterile), operiamo una diluizione del numero di microrganismi inizialmente presenti in esso, realizzando così una procedura equivalente a quella descritta nell’esempio 2.
• Allestendo delle diluizioni decimali seriali di un campione (ad es. 10g o 10ml di campione in 90ml di diluente sterile), operiamo una diluizione del numero di microrganismi inizialmente presenti in esso.

Quante diluizioni realizzare?

Al momento dell’analisi dobbiamo dunque decidere quante volte diluire il campione.

Il numero di diluizioni da realizzare può scaturire da una serie di considerazioni:

• può essere dettato dai criteri microbiologici da soddisfare per accertare se un campione risulta accettabile;
• può essere dettato da precedenti esperienze di analisi condotte su prodotti simili considerando la natura del campione, il tipo di processo tecnologico cui è stato sottoposto, le condizioni in cui viene conservato, ecc.;
• quando non si hanno notizie sufficienti sul campione per poter prevedere il numero potenziale di microrganismi in esso contenuto, allora è necessario diluire il campione almeno fino alla 10^-8-10^-9, considerando che 1 ml o 1 g di alimento contiene in genere non più di 10⁹-10¹⁰ microrganismi.

Procedura per la preparazione

Materiale occorrente

• Pipette sterili da 1 e ml.
• Tubi contenenti 9 ml di diluente sterile.

Operazioni

• Prelevare, con una pipetta sterile, 1 ml della prima diluizione (1:10).
• Trasferirlo in 9 ml di diluente sterile evitando il contatto tra la pipetta e il diluente.
• In tal modo si realizza una diluizione 1/100 (10^-2) del campione.
• Omogeneizzare con cura mediante agitatore automatico per 5-10 min.
• Ripetere le operazioni per ottenere diluizioni decimali successive (10^-3, 10^-4 ecc.).

NOTA: utilizzare sempre una nuova pipetta sterile per ogni diluizione da realizzare.

Tecniche di semina in piastra

1. Tecnica per inclusione dell’inoculo in substrato solidificabile (Tecnica “Pour Plate”): in una piastra petri sterile vuota si versa prima la sospensione del campione da analizzare (1 ml di inoculo), quindi si aggiunge il substrato agarizzato (12-15 ml) mantenuto in fusione a 45-46°C. Roteare delicatamente la piastra in modo da descrivere un 8 per 30 sec. al fine di miscelare l’inoculo (i microrganismi) con il substrato. Si lascia solidificare il substrato prima di incubare le piastre in termostato.
2. Tecnica per distribuzione superficiale dell’inoculo su substrato solido (Tecnica “Spread Plate”): le piastre contenenti l’adatto substrato nutritivo solidificato vengono preparate precedentemente all’operazione di inoculo. Le piastre pronte possono essere conservate a 4°C anche per una settimana prima dell’uso. L’inoculo (0,1 ml) viene depositato sulla superficie dell’agar e distribuito con una bacchettina di vetro a forma di L.

Incubazione delle piastre e numerazione delle colonie

Incubazione

Dopo la semina incubare le piastre capovolte (per evitare che si formi condensa sotto il coperchio) in termostato per tempi, temperatura e atmosfera adatti al tipo di microrganismo o popolazione microbica che si vuole numerare.

Numerazione delle colonie: considerazioni

• Se l’inoculo è distribuito omogeneamente nel substrato, teoricamente ogni cellula presente nel campione iniziale dovrebbe dare origine, in seguito a moltiplicazione, ad una colonia singola visibile ad occhio nudo.
• Selezionare solo le piastre che risultano contabili: numero di colonie tra 30 e 300 (o 25 e 250).
• Se si considerano piastre con meno di 30 colonie il risultato potrebbe essere poco accurato statisticamente mentre un numero di colonie superiore a 300 potrebbe risultare difficile da contare.

Risultati del conteggio

• Per il conteggio, il numero di colonie contato su una piastra è moltiplicato per il numero di volte in cui è stato diluito il campione iniziale.
• Ad esempio, se due piastre che sono state inoculate ciascuna con 1 ml della diluizione 1:1000 del campione iniziale presentano mediamente 50 colonie, allora 50 rappresenta 1/1000 del numero di colonie presenti in 1 g o 1 ml del campione iniziale.
• Dunque, il numero di colonie per g o ml del campione sarà calcolato moltiplicando 50×1000 = 5×10⁴ (1000 rappresenta il fattore della diluizione 1/1000, che, si ricorda, rappresenta l’inverso della diluizione)

Limiti di rilevamento

Campione alimentare solido. Il numero minimo di microrganismi teoricamente rilevabile è pari a:

• 10 UFC/g con la tecnica per inclusione;
• 100 UFC/g con la tecnica di inoculo superficiale;

Tali limiti risultano ovvi se si fa riferimento alla quantità massima di campione alimentare analizzabile con le due tecniche.

Campione alimentare liquido. Il numero minimo di microrganismi teoricamente rilevabile è pari a:

• 1 UFC/g con la tecnica per inclusione;
• 10 UFC/g con la tecnica di inoculo superficiale;

Tali limiti risultano ovvi se si fa riferimento alla quantità massima di campione alimentare analizzabile con le due tecniche.

Prossima lezione

Conteggio in terreno liquido: tecnica MPN (Most Probable Number)