Francesco Villani » 27.Principali terreni nutritivi e diluenti usati per l'analisi microbiologica degli alimenti

Diluenti usati in microbiologia

Presupposti e caratteristiche

I campioni alimentari solidi prima di essere analizzati, vanno omogeneizzati in un adatto diluente, al fine di disperdere i microrganismi nella fase liquida che può essere facilmente manipolata per l’analisi. La scelta del diluente è una fase molto importante dell’analisi, in quanto diluenti non adatti, come ad esempio l’acqua, possono causare danneggiamenti delle cellule microbiche, con conseguente sottostima del numero di microrganismi.

Le principali caratteristiche dei diluenti sono:

• isotonicità (stessa pressione osmotica delle cellule microbiche);
• assenza di componenti nutritivi (o presenti in minima quantità);
• bassa tensione superficiale (favorisce la miscelazione del liquido con il substrato agarizzato fluido).

Diluenti più comunemente usati

Diluenti più comunemente usati

Terreni nutritivi per la coltivazione dei microrganismi

Definizioni

Un terreno di coltura può essere definito come l’ambiente nutritivo artificiale creato in laboratorio per far crescere un microrganismo.

In base alla composizione in nutrienti si possono dividere in due gruppi:

• terreni a composizione chimica definita: se ne conosce l’esatta composizione percentuale delle sostanze chimiche (organiche e inorganiche) utilizzate per la loro formulazione;
• terreni complessi o a composizione indefinita: nella loro formulazione contengono sostanze di origine varia e, nella maggior parte dei casi, di derivazione naturale (animale e vegetale) di cui non è nota la precisa composizione dei nutrienti.

Definizioni

• Terreni nutritivi liquidi: detti anche brodi, sono preparati sciogliendo in acqua tutti i componenti necessari.
• Terreni nutritivi solidi: sono resi tali aggiungendo, alla soluzione dei nutrienti, una sostanza gelificante come l’agar, che è un mucopolisaccaride sulfonato estratto da alghe rosse che, una volta fluidificato a temperature superiori a 85°C, solidifica quando viene lasciato raffreddare a temperature inferiori a 45°C. In genere è usato a concentrazioni dell’1,5% per preparare terreni solidi e allo 0,75% per terreni semi-solidi (agar soft).

Definizioni

• Terreni per uso generale: presentano una composizione in nutrienti tale da soddisfare la crescita della maggior parte dei microrganismi di uno specifico gruppo (batteri, lieviti e muffe).
• Terreni selettivi: oltre ai normali componenti nutritivi, contengono sostanze chimiche che esercitano un’azione inibente nei confronti di alcuni microrganismi o gruppi di microrganismi, senza interferire, nelle dosi di utilizzo, con l’organismo da isolare.
• Terreni selettivi e differenziali: sono terreni selettivi ai quali sono aggiunte particolari sostanze chimiche che determinano una modificazione del terreno come conseguenza di una particolare attività metabolica del microrganismo da isolare, differenziandolo dalle specie che non sono in grado di utilizzare il composto differenziale (ad esempio la capacità del microrganismo di fermentare un particolare carboidrato o di produrre particolari metaboliti che rendono “caratteristica” la colonia microbica da isolare).

Fasi per la preparazione di un terreno di coltura

• Pesare esattamente i componenti secondo la ricetta.
• Aggiungere acqua distillata nella misura richiesta.
• Sciogliere gli ingredienti riscaldando fino a 40-50°C per i terreni liquidi e fino all’ebollizione per i terreni contenenti agar.
• Dispensare il terreno in bottiglie o in provette muniti di tappo.
• Sterilizzare in autoclave a 121°C (1 atmosfera di sovrapressione) per 15 minuti, in modo da eliminare tutti i microrganismi, sporigeni e non, contaminanti. Alcuni terreni vanno solo riscaldati fino ad ebollizione oppure sterilizzarli per filtrazione.
• Aggiungere al terreno sterile e raffreddato a 45-47°C eventuali supplementi selettivi sterili.
• Dopo sterilizzazione i terreni agarizzati possono essere dispensati in piastre di Petri oppure in tubi per batteriologia lasciandoli solidificare in posizione verticale oppure inclinata (agar a becco di clarino o agar slant).

Prossima lezione

Preparazione del campione per l’analisi e conteggio standard di cellule vitali su piastra (Standard Plate Counts)