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Rita Santamaria » 23.Maturazione dell'RNA


Tutti gli RNA eucariotici sono modificati

Lezione svolta in collaborazione con il Dott. Carlo Irace

Negli eucarioti, i prodotti della trascrizione vanno incontro ad un processo di maturazione.
Tutti i trascritti primari subiscono modificazioni post-trascrizionali, ma sono gli RNA messaggeri a subire le modificazioni maggiori.
Il processo di maturazione dell’mRNA comprende sia modificazioni a livello delle due estremità della molecola, sia lo splicing di segmenti del trascritto primario, un processo complicato che consente di eliminare segmenti corrispondenti alle sequenze introniche.
In seguito allo splicing, gli esoni vengono uniti per formare molecole di RNA mature pronte per la traduzione.
La quasi totalità delle modificazioni post-trascrizionali a carico dei pre-RNA hanno luogo nel nucleo della cellula.

Maturazione degli RNA ribosomiali

Il prodotto della RNA polimerasi I è un singolo precursore di grosse dimensioni molecolari, noto come pre-rRNA.
Questo trascritto primario viene processato da numerosi fattori di maturazione (proteine e ribonucleoproteine) che vanno a costituire complessi macromolecolari, chiamati processomi, necessari per la maturazione del pre-rRNA.
I nucleotidi vanno incontro a modificazioni, sia a livello delle basi che del ribosio.
Il taglio enzimatico del precursore in tre rRNA maturi rappresenta la fase finale del processo di maturazione (Figura 1).

Figura tratta da:
J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochimica, Zanichelli, 6a edizione 2008, traduzione di P.L. Ipata, revisione di E. Melloni, F. Salamino.

Fig. 1 Processo di maturazione del pre-rRNA eucariotico ad opera dei processomi

Fig. 1 Processo di maturazione del pre-rRNA eucariotico ad opera dei processomi


Maturazione degli RNA transfer

I prodotti più importanti della RNA polimerasi III degli eucarioti, gli RNA transfer, subiscono rilevanti modificazioni post-sintetiche.
In particolare, una ribonucleasi specifica elimina la sequenza leader al 5′, mentre l’estremità 3′-OH viene sostituita con la sequenza funzionale CCA-3′-OH.
Per mezzo di un processo di splicing, viene rimossa una sequenza intronica per originare l’ansa dell’anticodone.
Inoltre, i tRNA eucariotici vengono modificati a livello delle basi e del ribosio (Figura 2).

Figura tratta da:
J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochimica, Zanichelli, 6a edizione 2008, traduzione di P.L. Ipata, revisione di E. Melloni, F. Salamino.

Fig. 2 Maturazione dei tRNA eucariotici

Fig. 2 Maturazione dei tRNA eucariotici


Maturazione degli mRNA

Il pre-mRNA, prodotto della RNA polimerasi II, è il trascritto primario che negli eucarioti subisce le modificazioni maggiori.
Oltre ad essere modificato ad entrambe le estremità 5′ e 3′, il pre-mRNA subisce il processo di splicing per rimuovere gli introni (Figura 3).
I prodotti della maturazione sono trascritti contenenti un messaggio continuo, pronti a trasferire l’informazione genetica per la fase della traduzione.

Figure tratte da:
J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochimica, Zanichelli, 6a edizione 2008, traduzione di P.L. Ipata, revisione di E. Melloni, F. Salamino
D.L. Nelson, M.M. Cox, I principi di biochimica di Lehninger, Zanichelli, 4a edizione, 2006, traduzione di P. Capini, E. Regola, revisione di E. Melloni, F. Salamino

Fig. 3 Modificazioni degli mRNA eucariotici nel corso del processo di maturazione

Fig. 3 Modificazioni degli mRNA eucariotici nel corso del processo di maturazione


5′-capping

Come nei procarioti, anche l’RNA messaggero degli eucarioti inizia con una A o con una G.
Subito dopo la trascrizione, il gruppo trifosfato al 5′ viene modificato con una molecola di GTP per formare un insolito legame fosfodiesterico 5′→5′ (Figura 4).
Questo motivo strutturale all’estremità 5′ è detto cappuccio (5′-cap).
Questa modifica dell’estremità 5′ conferisce stabilità alla molecola di mRNA, proteggendola dalla degradazione causata da fosfatasi e nucleasi, ed inoltre aumenta l’affinità del trascritto per i ribosomi.

Figura tratta da:
J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochimica, Zanichelli, 6a edizione 2008, traduzione di P.L. Ipata, revisione di E. Melloni, F. Salamino.

Fig. 4 Il cappuccio al 5′ dei trascritti di pre-mRNA

Fig. 4 Il cappuccio al 5' dei trascritti di pre-mRNA


Poliadenilazione dell’RNA messaggero

La quasi totalità degli RNA messaggeri eucariotici contiene una coda di poliadenilato, poli(A), aggiunta all’estremità 3′-OH dopo la trascrizione.
Una specifica endonucleasi riconosce una sequenza di consenso sul trascritto e opera un taglio che attiva, a sua volta, una poli(A) polimerasi che catalizza l’aggiunta di una sequenza di residui di adenilato all’estremità 3′ (Figura 5).
La coda di poli(A) non è codificata dal DNA e può essere lunga anche 80-250 nucleotidi.

Come il cappuccio al 5′, la coda di poli(A) aumenta la stabilità degli mRNA e ne incrementa l’efficienza traduzionale.

A differenza delle altre modificazioni post-sintetiche, la poliadenilazione dell’mRNA può avvenire anche nel citoplasma nell’imminenza della traduzione.

Figura tratta da:
J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochimica, Zanichelli, 6a edizione 2008, traduzione di P.L. Ipata, revisione di E. Melloni, F. Salamino.

Fig. 5 Poliadenilazione delle molecole di mRNA all’estremità 3′-OH

Fig. 5 Poliadenilazione delle molecole di mRNA all'estremità 3'-OH


Splicing dell’RNA messaggero

Lo splicing è il meccanismo molecolare, estremamente preciso e selettivo, mediante il quale gli introni vengono rimossi e gli esoni riuniti per formare un RNA messaggero con un messaggio genetico continuo.

In tutti gli eucarioti le giunzioni introne-esone nei trascritti primari di mRNA sono accuratamente segnalate e presentano motivi strutturali comuni che originano sequenze di consenso conservate.

Queste regioni sono note come siti di splicing 5′ e 3′. All’interno degli introni, il sito di ramificazione contiene un’altra sequenza invariante.
Queste regioni sono essenziali per un corretto processo di splicing (Figura 6).

Fig. 6 Siti di splicing nel trascritto primario di RNA messaggero

Fig. 6 Siti di splicing nel trascritto primario di RNA messaggero


Meccanismo dello splicing

La chimica del processo di splicing è semplice e consiste in due reazioni consecutive di transesterificazione.
Il gruppo 2′-OH di un residuo di adenilato al sito di ramificazione produce un attacco nucleofilo al sito di splicing 5′, formando un legame fosfodiesterico atipico 2′→5′.
In corrispondenza di questo sito, si genera un cosiddetto intermedio a forma di laccio.

Il gruppo 3′-OH dell’esone a monte può adesso attaccare il sito di splicing 3′, legando gli esoni 1 e 2 tra di loro e liberando l’introne a forma di laccio (Figura 7).

Nel corso dell’intero processo si rompono e si formano lo stesso numero di legami fosfodiesterici: pertanto lo splicing può avvenire senza apporto energetico.

Figura tratta da:
J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochimica, Zanichelli, 6a edizione 2008, traduzione di P.L. Ipata, revisione di E. Melloni, F. Salamino.

Fig. 7 Meccanismo di splicing sui precursori degli mRNA

Fig. 7 Meccanismo di splicing sui precursori degli mRNA


Lo “spliceosoma”

Il processo di splicing, sebbene semplice da un punto di vista chimico, richiede la cooperazione tra numerosi fattori.
In particolare, piccoli RNA nucleari (snRNA) si associano a proteine nucleari per formare snRNP (small nuclear RiboNucleoproteic Particles) che, in presenza di altri fattori di splicing, costituiscono il complesso dinamico macromolecolare 60S dello spliceosoma (Figura 8).

Nello spliceosoma, l’interazione che avvia il processo di splicing avviene tra il sito di splicing 5′ di un trascritto di pre-mRNA ed uno snRNA di tipo U1.
Questa interazione è basata sulla formazione di doppie eliche intermolecolari di tipo RNA-RNA tra sequenze conservate complementari tra di loro.

Fig. 8 Organizzazione e funzione dello spliceosoma

Fig. 8 Organizzazione e funzione dello spliceosoma


RNA catalitici

Nello spliceosoma l’interazione tra regioni complementari conservate, localizzate ai siti di splicing e di ramificazione dei trascritti primari e negli snRNA, consente riarrangiamenti spaziali del complesso macromolecolare che rendono possibili i processi di transesterificazione.

I centri catalitici all’interno dello spliceosoma sono costituiti esclusivamente da molecole di RNA.
Gli snRNA hanno pertanto un ruolo essenziale nel dirigere l’allineamento dei siti di splicing e nei meccanismi catalitici (Figure 9 e 10).
I riarrangiamenti molecolari del complesso e le interazioni dinamiche sono possibili grazie all’azione di specifiche RNA elicasi ATP-dipendenti, che permettono di rompere e di riformare specifiche eliche RNA-RNA.

Figure tratte da:
J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochimica, Zanichelli, 6a edizione 2008, traduzione di P.L. Ipata, revisione di E. Melloni, F. Salamino.

Fig. 9 Interazioni dinamiche tra RNA e formazione dei centri catalitici dello splicing

Fig. 9 Interazioni dinamiche tra RNA e formazione dei centri catalitici dello splicing

Fig. 10 Centri catalitici di splicing nello spliceosoma

Fig. 10 Centri catalitici di splicing nello spliceosoma


Splicing difettosi e malattie genetiche

Mutazioni sia nei siti di splicing che nei fattori di splicing possono causare rimozioni di introni difettose alla base di patologie ereditarie.
Circa il 15% delle malattie genetiche ereditarie è causato infatti da difetti di splicing.
Una mutazione puntiforme nel gene della β-globina origina un nuovo sito di splicing e provoca la talassemia (Figura 11).
Mutazioni nei siti di splicing 5′ e 3′ causano splicing aberranti, ma anche mutazioni localizzate negli introni possono originare nuovi siti di splicing.
I risultanti mRNA difettosi vengono normalmente degradati piuttosto che tradotti.

Mutazioni patogene possono anche verificarsi nei fattori di splicing, in particolare in alcuni tipi di snRNA.

Figura tratta da:
J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochimica, Zanichelli, 6a edizione 2008, traduzione di P.L. Ipata, revisione di E. Melloni, F. Salamino.

Fig. 11 Un difetto nello splicing causa la talassemia

Fig. 11 Un difetto nello splicing causa la talassemia


Trascrizione e maturazione sono processi accoppiati

Nelle nostre cellule, trascrizione e maturazione degli mRNA avvengono in modo sequenziale e coordinato.

Dopo aver reclutato e attivato la RNA polimerasi II, il complesso basale della trascrizione, grazie all’attività chinasica del fattore di trascrizione TFIIH, fosforila diversi residui localizzati sul dominio carbossi-terminale (CTD) dell’enzima.
Il CTD fosforilato lega enzimi e fattori necessari per il 5′-capping, lo splicing e la poliadenilazione, portandoli in prossimità dei loro siti di azione sul pre-mRNA ancora in fase di allungamento (Figura 12).

Figura tratta da:
J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochimica, Zanichelli, 6a edizione 2008, traduzione di P.L. Ipata, revisione di E. Melloni, F. Salamino.

Fig. 12 Accoppiamento trascrizione e maturazione degli mRNA

Fig. 12 Accoppiamento trascrizione e maturazione degli mRNA


Splicing alternativo

Lo splicing alternativo è un processo attraverso il quale più mRNA possono essere generati dallo stesso pre-mRNA unendo in modo diverso gli esoni (Figura 13).

Gli introni possono essere escissi in maniera diversa dando origine a proteine diverse o diverse forme di una stessa proteina.

Lo splicing alternativo consente alle cellule degli organismi superiori di aumentare significativamente il numero delle proteine che possono essere codificate dal genoma.

Fig. 13 Lo splicing alternativo

Fig. 13 Lo splicing alternativo


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