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Rita Santamaria » 21.Replicazione del DNA

Replicazione semiconservativa del DNA

Lezione svolta in collaborazione con il Dott. Carlo Irace

Il modello della doppia elica di DNA, basato su specifici appaiamenti delle basi, suggerisce immediatamente un meccanismo di replicazione della molecola.
Infatti, una doppia elica separata nelle due catene che la costituiscono può essere replicata, dato che ciascuna catena diventa lo stampo molecolare sui cui sintetizzare una catena complementare.
Questo tipo di replicazione è detto replicazione semiconservativa (Figura 1).

Il materiale genetico deve essere copiato con assoluta fedeltà per garantire la trasmissione delle informazioni genetiche.
Un tale grado di precisione viene raggiunto solo attraverso un complesso sistema coordinato di controllo e di correzione che coinvolge oltre 20 proteine tra cui le DNA polimerasi altamente processive, i principali enzimi della replicazione del DNA.

Fig. 1 Meccanismo di replicazione semiconservativo della doppia elica di DNA

Separazione delle catene: la forcella di replicazione

Per replicare il DNA, le catene della doppia elica devono prima separarsi, almeno localmente, in modo che ciascuna possa funzionare da stampo molecolare per la sintesi di nuove catene polinucleotidiche.

La forcella di replicazione è la struttura in cui avviene la duplicazione del DNA.
E’ formata da una molecola di DNA in cui i due filamenti complementari sono separati per un tratto.

Il processo è regolato da specifici enzimi, le elicasi, che utilizzano l’energia immagazzinata nell’ATP per separare le catene della doppia elica (Figura 2).

Le elicasi costituiscono una vasta famiglia di enzimi, e possono muoversi in entrambe le direzioni 5′→3′ e 3′→5′ lungo molecole sia di DNA che di RNA.
Sono pertanto enzimi essenziali sia per la replicazione del materiale genetico che per lo splicing dell’RNA.

Figure tratte da:
J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochimica, Zanichelli, 6a edizione 2008, traduzione di P.L. Ipata, revisione di E. Melloni, F. Salamino.

Fig. 2 Forcella di replicazione e meccanismo di azione delle DNA-elicasi

Topoisomerasi

La formazione della forcella di replicazione ad opera delle elicasi introduce superavvolgimenti nelle regioni adiacenti della doppia elica che generano tensioni conformazionali.
Queste tensioni sono risolte dall’azione di specifici enzimi, le topoisomerasi, che consentono all’apparato replicativo di procedere lungo la doppia elica.
Le topoisomerasi possono introdurre o eliminare superavvolgimenti nella doppia elica del DNA (Figura 3).

Le topoisomerasi di tipo I, mediante complessi meccanismi molecolari, catalizzano il rilassamento del DNA, un processo termodinamicamente favorito.

Le topoisomerasi di tipo II utilizzano energia libera fornita dall’ATP per aggiungere superavvolgimenti al DNA.
Entrambi i tipi di topoisomerasi hanno ruoli importanti nella replicazione, nella trascrizione e nella ricombinazione del DNA.

Figure tratte da: J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochimica, Zanichelli, 6a edizione 2008, traduzione di P.L. Ipata, revisione di E. Melloni, F. Salamino.
D.L. Nelson, M.M. Cox, I principi di biochimica di Lehninger, Zanichelli, 4a edizione, 2006, traduzione di P. Capini, E. Regola, revisione di E. Melloni, F. Salamino.

Fig. 3 Superavvolgimento della doppia elica di DNA durante la replicazione

Sintesi delle catene di DNA

I substrati per la sintesi delle nuove catene di DNA sono i deossiribonucleotidi 5′-trifosfato, che vengono aggiunti uno alla volta all’estremità 3′ di un filamento di DNA preesistente.

La DNA polimerasi catalizza la sintesi delle catene polinucleotidiche. Ciascun nucleotide trifosfato si appaia con la base complementare sullo stampo e solo successivamente la polimerasi forma il legame fosfodiestere (Figura 4).
Le DNA polimerasi DNA-dipendenti sono quindi enzimi diretti da stampi molecolari.

La reazione richiede i quattro precursori attivati, dATP, dGTP, dCTP e dTTP, la presenza del cofattore Mg²⁺ ed avviene direttamente sullo catena di DNA stampo.
Per iniziare il processo di sintesi, la DNA polimerasi richiede un primer di innesco, ovvero un terminale 3′-OH libero su cui aggiungere deossinucleotidi.

Al contrario, le RNA polimerasi non necessitano di un primer di innesco.

Figura tratta da:
J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochimica, Zanichelli, 6a edizione 2008, traduzione di P.L. Ipata, revisione di E. Melloni, F. Salamino.

Fig. 4 Meccanismo catalitico della DNA polimerasi e allungamento della catena in direzione 5'→3'

DNA polimerasi

I procarioti hanno 5 tipi di DNA polimerasi:
Polimerasi I, II, III, IV, V
La DNA polimerasi I è costituita da un singolo polipeptide che presenta tre diverse attività catalitiche (Figura 5):
- l’attività polimerasica 5′→3′ per la sintesi di DNA;
- l’attività esonucleasica 3′→5′ per la correzione delle bozze (“proof reading”);
- l’attività esonucleasica 5′→3′ per la rimozione dei primer.
La DNA polimerasi III, un complesso multienzimatico costituito da numerose subunità, è l’enzima processivo più importante per la replicazione del DNA batterico.
La processività consente all’enzima di catalizzare reazioni consecutive senza rilasciare lo stampo molecolare, catalizzando la formazione di migliaia di legami fosfodiesterici (Figura 6).
Le DNA polimerasi II, IV e V sono coinvolte nel riparo del DNA.
Gli eucarioti hanno diverse classi di DNA polimerasi (α, β, γ, δ, ε).
La DNA polimerasi δ è il principale enzima processivo per replicare il materiale genetico della cellula.

Figure tratte da: J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochimica, Zanichelli, 6a edizione 2008, traduzione di P.L. Ipata, revisione di E. Melloni, F. Salamino.

Fig. 5 Struttura della DNA polimerasi I dei procarioti

Fig. 6 Complesso multienzimatico della DNA polimerasi III procariotica altamente processiva

Specificità e fedeltà della replicazione

Il DNA deve essere replicato con assoluta fedeltà.
Il legame dei dNTP allo stampo mediante i legami idrogeno, ma anche la forma delle basi e controlli sterici nel sito attivo della DNA-polimerasi, concorrono al corretto appaiamento delle basi (Figura 7).

La frequenza di errore viene ridotta anche grazie ad accurati meccanismi enzimatici.
Infatti, tutte le DNA polimerasi possiedono un’attività esonucleasica 3′→5′ che consente di rimuovere un nucleotide appena inserito (Figura 8).
Tale attività di “proof reading” (lettura delle bozze) è altamente specifica per gli appaiamenti sbagliati e aggiunge un ulteriore fattore di accuratezza che riduce la frequenza di errore totale.

Correzioni post-sintetiche portano la precisione replicativa a meno di un errore ogni 3 miliardi di nucleotidi aggiunti.
Questo consente di replicare genomi complessi come quello umano, costituito da oltre 3 miliardi di coppie di basi, con assoluta garanzia di fedeltà.

Figure tratte da:
J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochimica, Zanichelli, 6a edizione 2008, traduzione di P.L. Ipata, revisione di E. Melloni, F. Salamino.

Fig. 7 La complementarietà tra le basi è cruciale per la fedeltà della replicazione

Fig. 8 L'attività di “proof reading” delle DNA polimerasi aumenta l'accuratezza della replicazione

Primasi e primer di innesco

Le DNA polimerasi non possono sintetizzare catene di DNA senza un primer, un piccolo segmento di acido nucleico con un gruppo ossidrilico libero in posizione 3′-OH.

Durante la replicazione del materiale genetico, il primer è costituito da RNA.
Una RNA polimerasi DNA-dipendente, detta primasi, sintetizza un piccolo tratto di RNA complementare allo stampo molecolare, utilizzato come primer dalla DNA polimerasi (Figura 9).

Una volta iniziata la sintesi di DNA, il primer di RNA viene digerito da enzimi con attività 5′→3′ esonucleasica.

Al contrario, tutte le RNA polimerasi possono iniziare la sintesi di RNA senza l’intervento di un primer.

Fig. 9 Sintesi del primer ad opera delle primasi nel corso della replicazione del DNA

Catena leader e catena ritardata

Entrambe le catene di DNA parentale fanno da stampo per la sintesi della nuova molecola di DNA.
Le DNA polimerasi possono allungare le catene esclusivamente in direzione 5′→3′.
Per questo motivo, una catena è sintetizzata senza interruzioni ed è chiamata catena leader (o catena veloce), mentre l’altra viene sintetizzata in modo discontinuo, originando i frammenti di Okazaki, ed è definita catena ritardata (o catena lenta) (Figura 10).

Con il procedere della replicazione, i frammenti di Okazaki sono uniti l’uno all’altro mediante la DNA ligasi
Le DNA ligasi catalizzano la formazione di legami fosfodiesterici tra un gruppo 3′-OH ed un gruppo fosfato in posizione 5′ a spese di ATP (Figura 11).

La sintesi discontinua della catena ritardata fa sì che mentre la polimerizzazione dei deossinucleotidi nei singoli frammenti di Okazaki avviene in direzione canonica 5′→3′, la crescita complessiva della catena avviene in direzione 3′→5′.

Figure tratte da:
J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochimica, Zanichelli, 6a edizione 2008, traduzione di P.L. Ipata, revisione di E. Melloni, F. Salamino.

Fig. 10 Sintesi delle catene di DNA alla forcella di replicazione

Fig. 11 Reazione catalizzata dalla DNA ligasi

DNA polimerasi altamente processive

Le DNA polimerasi che devono replicare l’intero genoma, come la DNA pol III procariotica e la DNA pol δ eucariotica, sono caratterizzate da elevata capacità catalitica, fedeltà di replicazione e processività.

Le DNA polimerasi sintetizzano simultaneamente ed in modo coordinato la catena leader e la catena lenta sulla forcella di replicazione.
La sintesi della catena lenta è tuttavia più complessa.
In particolare, gli oloenzimi della DNA polimerasi forzano lo stampo della catena lenta a ripiegarsi a formare un’ansa, in modo da attraversare il sito catalitico nella stessa direzione dello stampo della catena leader.
Man mano che la forcella di replicazione avanza, si forma una nuova ansa che porta alla sintesi di un nuovo frammento di Okazaki (Figura 12).

Le DNA polimerasi processive posseggono anche attività esonucleasica 5′→3′, che rimuove i primer utilizzati per la sintesi dei frammenti di Okazaki.
Queste porzioni vengono poi sostituite con DNA, ed infine i frammenti sono uniti per opera delle DNA ligasi.

Figure tratte da: J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochimica, Zanichelli, 6a edizione 2008, traduzione di P.L. Ipata, revisione di E. Melloni, F. Salamino.

Fig. 12 Coordinazione nella sintesi delle due catene di DNA

Origine e regolazione della replicazione del DNA

Nei batteri la replicazione inizia da un unico sito all’interno del cromosoma circolare.
Negli eucarioti, a causa delle dimensioni molto più grandi del genoma, vi sono circa 30.000 origini della replicazione, e ciascun cromosoma ne contiene diverse centinaia.
Ogni origine di replicazione prende il nome di replicone, da cui il processo si avvia in maniera bidirezionale.
Tutto ciò richiede numerosi meccanismi di controllo che assicurino la corretta coordinazione tra unità replicative.

Tutti gli eventi molecolari della replicazione del DNA sono strettamente correlati con il ciclo cellulare.
Questa coordinazione richiede molti punti di controllo, nonché l’intervento di numerose proteine ed enzimi (Figura 13).

Fig. 13 Coordinazione tra ciclo cellulare eucariotico e inizio della replicazione a livello dei repliconi

Telomeri e telomerasi

A differenza dei cromosomi circolari batterici, ad ogni ciclo di replicazione i cromosomi eucariotici lineari vanno incontro ad un naturale e continuo processo di accorciamento nelle regioni terminali.

Per non perdere vitali informazioni genetiche, nelle cellule germinali vengono estesi i telomeri, estremità accessorie che dovrebbero evitare o quanto meno minimizzare l’accorciamento dei cromosomi (Figura 14).

Il DNA telomerico è sintetizzato dalle telomerasi, DNA polimerasi RNA-dipendenti altamente specializzate che introducono centinaia di ripetizioni nucleotidiche alle estremità dei cromosomi.
La telomerasi è un particolare tipo di trascrittasi inversa.

Ci sono numerose evidenze che l’accorciamento progressivo dei telomeri sia associato alla senescenza cellulare.

Fig. 14 Colorazione mediante immunofluorescenza dei telomeri alle estremità dei cromosomi umani

Sistemi di riparazione del DNA

In tutti gli organismi, il DNA subisce danni e alterazioni che richiedono una riparazione continua e accurata per preservare l’integrità dell’informazione genetica.
Sebbene mutazioni di diverso grado siano alla base dell’evoluzione molecolare, la sopravvivenza degli organismi sarebbe minacciata se non venissero riparati i danni potenzialmente mutageni e citotossici che fattori endogeni ed esogeni provocano sul DNA.
L’idrolisi spontanea e l’ossidazione dovuta all’ossigeno del metabolismo cellulare sono tra i fattori endogeni più pericolosi, mentre i raggi UV e i mutageni chimici sono tra i principali fattori esogeni.
La persistenza di queste alterazioni può causare l’arresto della replicazione o della trascrizione del DNA, blocco del ciclo cellulare e apoptosi, mentre la loro incorretta riparazione determina l’introduzione di mutazioni ereditarie più o meno estese (mutazioni puntiformi, delezioni, inserzioni).
I meccanismi di correzione sono molteplici, spesso danno-specifici e consistono per lo più in un intervento sulla base alterata o in un’azione più estesa sulla zona danneggiata.
Tuttavia, quando gli insulti esogeni sono ricorrenti ed i danni si accumulano rispetto al potere di autoriparazione cellulare, allora il genoma può subire mutazioni che a loro volta possono originare varie patologie molecolari.
In alcuni casi, la cellula può modificarsi fino a divenire neoplastica dando avvio allo sviluppo del cancro.

Nella Figura 15 sono schematicamente illustrate le conseguenze dei danni al materiale genetico ed i principali meccanismi di riparo del DNA.

Difetti nelle componenti proteiche deputate alla riparazione del DNA possono condurre all’insorgenza di patologie tumorali (Figura 16).

Sistemi di riparazione del DNA

Fig. 15 Possibili conseguenze dei danni al materiale genetico e principali meccanismi di riparo del DNA

Difetti delle proteine deputate al riparo del DNA

Fig. 16 Difetti nei meccanismi di riparo del DNA possono condurre all'insorgenza di patologie tumorali

Riparazione diretta del DNA

La riparazione diretta del DNA consiste nell’individuazione del danno e nella correzione sul posto della regione danneggiata.
Alcuni dimeri di timine formati dall’assorbimento di fotoni ad elevato contenuto energetico possono essere riparati mediante l’intervento diretto di specifici enzimi riparatori, tra i quali enzimi fotoriparatori (Figura 17).

Figura tratta da:
J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochimica, Zanichelli, 6a edizione 2008, traduzione di P.L. Ipata, revisione di E. Melloni, F. Salamino.

Fig. 17 Riparazione diretta di dimeri di timine ad opera della DNA fotoliasi

Riparazione del DNA per escissione di nucleotidi

Uno degli esempi meglio conosciuti di riparazione per escissione di nucleotidi è l’eliminazione di dimeri di pirimidine formati per effetto di fotoni ultravioletti. Questo meccanismo richiede l’azione sequenziale di una specifica endonucleasi di escissione, una DNA polimerasi ed una DNA ligasi (Figura 18).

Figura tratta da:
J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochimica, Zanichelli, 6a edizione 2008, traduzione di P.L. Ipata, revisione di E. Melloni, F. Salamino.

Fig. 18 Riparazione di un dimero di timina per escissione di nucleotidi

Riparazione del DNA per rimozione di basi

Questo sistema di riparo del DNA da eventuali danni causati da fattori sia endogeni che esogeni è basato sull’azione di specifiche proteine altamente specializzate che provvedono ad eliminare, in maniera sequenziale, la base non corretta ed il corrispondente residuo deossinucleotidico.

Il processo si origina con l’individuazione della regione danneggiata e la successiva specifica segnalazione per metilazione della base.
Progressivamente si verificano le seguenti reazioni:

spostamento della base metilata fuori della doppia elica;
catalisi da parte di una glicosilasi che libera la base con formazione di un cosiddetto sito AP;
catalisi di parte di una d-ribosio fosfodiesterasi (AP endonucleasi);
attivazione di una DNA polimerasi ed inserimento del corretto deossinucleotide;
catalisi da parte della DNA ligasi che chiude il filamento di DNA.