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Rita Santamaria » 22.Trascrizione dell'RNA


Tutti gli RNA sono prodotti genici

Lezione svolta in collaborazione con il Dott. Carlo Irace

L’informazione contenuta nel DNA diventa utilizzabile quando viene espressa sotto forma di RNA e proteine.

La sintesi dell’RNA è una tappa fondamentale dell’espressione dell’informazione genetica.

La trascrizione produce non solo l’RNA messaggero (mRNA), ma tutti i tipi di molecole di RNA, stabili e a breve emivita.

Tutte le molecole di RNA prodotte dalla trascrizione partecipano al processo di espressione genica (Figura 1).

Nelle cellule eucariotiche i trascritti primari di RNA, in particolare i pre-mRNA, sono modificati estensivamente per diventare molecole di RNA mature, pronte a svolgere la loro funzione biologica.

Fig. 1 Tutti gli RNA partecipano al processo di espressione genica

Fig. 1 Tutti gli RNA partecipano al processo di espressione genica


La trascrizione è catalizzata dalle RNA polimerasi

La trascrizione trasforma l’informazione contenuta nella sequenza di basi del DNA in una sequenza nucleotidica di RNA.
La sintesi dell’RNA è catalizzata dalla RNA polimerasi DNA-dipendente (Figura 2).

La sintesi dell’RNA è la stessa sia in procarioti che in eucarioti, ma la regolazione del processo è molto più complessa negli eucarioti.

La sintesi dell’RNA consta di tre fasi:

  • inizio;
  • allungamento;
  • terminazione.

Figura tratta da:
J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochimica, Zanichelli, 6a edizione 2008, traduzione di P.L. Ipata, revisione di E. Melloni, F. Salamino.

Fig. 2 RNA polimerasi procariotica ed eucariotica

Fig. 2 RNA polimerasi procariotica ed eucariotica


RNA polimerasi

Le RNA polimerasi sintetizzano RNA in direzione 5′→3′ utilizzando i 4 tipi di riboNTP come precursori e copiando lo stampo di DNA (Figura 3).

Le RNA polimerasi:

  • sono enzimi diretti da stampi molecolari;
  • non necessitano di primer di innesco;
  • non sono dotate di attività di correzione dei trascritti.

Le RNA polimerasi sono capaci di individuare e trascrivere selettivamente i geni interagendo, con l’ausilio di altre proteine (elementi trans), con siti specifici del DNA (elementi cis) presenti nella regione del promotore della trascrizione.
Una volta riconosciuto un elemento cis, la RNA polimerasi inizia la sintesi dell’RNA (Figura 4).

L’enzima è completamente processivo, per cui un trascritto completo viene sintetizzato da un’unica RNA polimerasi.

Fig. 3 Proprietà delle RNA polimerasi DNA-dipendenti

Fig. 3 Proprietà delle RNA polimerasi DNA-dipendenti

Fig. 4 Funzioni della RNA polimerasi dei procarioti

Fig. 4 Funzioni della RNA polimerasi dei procarioti


Reazione catalizzata dalla RNA polimerasi

La chimica della sintesi degli RNA è la stessa per tutti i tipi di RNA.
Dopo aver selezionato il corretto nucleotide trifosfato, l’enzima catalizza la formazione del legame fosfodiesterico utilizzando ioni Mg2+ quali cofattori (Figura 5).

La reazione di allungamento dell’RNA in fase di sintesi è:

(RNA)n + rNTP → (RNA)n+1 + PPi

Nei batteri, l’enzima intero (oloenzima) è costituito dalle subunità α2ββ’σ.
La subunità σ è fondamentale perché aiuta la RNA polimerasi nella ricerca del sito di inizio della trascrizione.
La sua dissociazione origina il nucleo dell’enzima, ovvero la RNA polimerasi α2ββ’ cataliticamente attiva.

Figura tratta da:
J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochimica, Zanichelli, 6a edizione 2008, traduzione di P.L. Ipata, revisione di E. Melloni, F. Salamino.

Fig. 5 Catalisi della RNA polimerasi e allungamento della catena di RNA

Fig. 5 Catalisi della RNA polimerasi e allungamento della catena di RNA


Complementarietà dell’RNA allo stampo di DNA

Una volta iniziata la sintesi dell’RNA, la RNA polimerasi si sposta unidirezionalmente lungo la catena stampo di DNA (filamento antisenso) trascrivendo RNA in direzione 5′ → 3′ (Figura 6).

La composizione in basi della catena di RNA neosintetizzato è complementare a quella della catena stampo di DNA (filamento antisenso), ed esattamente simile a quella della catena codificante di DNA (filamento senso), fatta eccezione per la presenza dell’uracile al posto della timina (Figura 7).

Fig. 6 Rappresentazione schematica della sintesi dell’RNA sulla catena stampo del DNA

Fig. 6 Rappresentazione schematica della sintesi dell'RNA sulla catena stampo del DNA

Fig. 7 Complementarietà nella composizione in basi dell’RNA rispetto allo stampo molecolare.

Fig. 7 Complementarietà nella composizione in basi dell'RNA rispetto allo stampo molecolare.


Promotori della trascrizione

La trascrizione inizia a livello di determinate regioni del DNA poste al 5′ del gene.
Tali regioni costituiscono il promotore del gene.
Gli elementi cis presenti nella regione del promotore dirigono la RNA polimerasi verso il sito di inizio della trascrizione.
I promotori dei geni dei procarioti presentano due sequenze conservate a monte del sito di inizio della trascrizione.
Queste due sequenze sono localizzate in una regione nota come nucleo del promotore, in posizione ben precisa rispetto al sito di inizio della trascrizione (-10 e -35) (Figura 8).
Il primo nucleotide di DNA che viene trascritto in RNA è indicato come +1.

In funzione delle sequenze consenso presenti, i promotori differiscono molto per la loro efficacia (Figura 9).
I geni i cui promotori mostrano sequenze di consenso altamente conservate, sono trascritti con elevata frequenza.

Alcuni fattori trascrizionali di regolazione (attivatori o repressori) partecipano alla regolazione di questo processo.

Figure tratte da: J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochimica, Zanichelli, 6a edizione 2008, traduzione di P.L. Ipata, revisione di E. Melloni, F. Salamino.

Fig. 8 Principali sequenze consenso del promotore procariotico ed eucariotico.

Fig. 8 Principali sequenze consenso del promotore procariotico ed eucariotico.

Fig. 9 Sequenze consenso -10 e -35 nel nucleo del promotore procariotico .

Fig. 9 Sequenze consenso -10 e -35 nel nucleo del promotore procariotico .


Subunità σ della RNA polimerasi

Nei procarioti la subunità σ è necessaria per posizionare la RNA polimerasi sul sito specifico di inizio della trascrizione.

L’oloenzima completo (α2ββ’σ) si sposta lungo la doppia elica di DNA ricercando le sequenze consenso sul promotore mediante interazioni deboli che si stabiliscono tra alcune regioni della subunità σ ed i gruppi chimici esposti dalle basi nelle sequenze di consenso (Figura 10).

La subunità σ ha un ruolo critico nella trascrizione.

Diversi tipi di subunità σ riconoscono promotori diversi, consentendo la regolazione della espressione genica nei procarioti.

Figura tratta da:
J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochimica, Zanichelli, 6a edizione 2008, traduzione di P.L. Ipata, revisione di E. Melloni, F. Salamino.

Fig. 10 Oloenzima della RNA polimerasi prima del distacco della subunità σ

Fig. 10 Oloenzima della RNA polimerasi prima del distacco della subunità σ


Bolla di trascrizione

Una volta avvenuto il riconoscimento delle specifiche sequenze consenso sul promotore, un tratto di DNA deve aprirsi in modo da funzionare da stampo molecolare.

La transizione da complesso promotore chiuso a complesso promotore aperto segna l’inizio della sintesi della catena di RNA.

La regione che contiene la RNA polimerasi, il DNA e la molecola di RNA nascente è chiamata bolla di trascrizione (Figura 11).
In questa regione, il filamento di RNA di nuova sintesi ibridizza con lo stampo di DNA.

Contrariamente alla sintesi del DNA, la sintesi dell’RNA può iniziare de novo.
La prima base aggiunta al 5′ è pppG oppure pppA.

Fiigura 11 Formazione della bolla di trascrizione e inizio della sintesi di RNA

Fiigura 11 Formazione della bolla di trascrizione e inizio della sintesi di RNA


Terminazione della trascrizione nei procarioti

Anche la terminazione della trascrizione è controllata in modo preciso.
Le regioni trascritte del DNA stampo contengono segnali di terminazione (o di stop).
Uno dei più comuni è una regione palindromica ricca in GC, seguita da una regione ricca in AT.
Il risultato è la formazione di un trascritto che origina una struttura a forcina (“stem and loop“) seguita da una regione ricca in uridilato che causano la dissociazione dell’elica ibrida DNA-RNA. Come conseguenza, il DNA si riavvolge e l’RNA polimerasi lascia la doppia elica (Figura 12).

In altri casi è necessario l’intervento di fattori proteici (o attenuatori) per terminare la trascrizione, come ad esempio la proteina rho (ρ), una DNA-RNA elicasi ad attività ATPasica che riconosce sequenze consenso localizzate sul trascritto in fase di sintesi (Figura 13).

Figure tratte da:
J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochimica, Zanichelli, 6a edizione 2008, traduzione di P.L. Ipata, revisione di E. Melloni, F. Salamino.

Fig. 12 Principale segnale di stop della trascrizione nei procarioti

Fig. 12 Principale segnale di stop della trascrizione nei procarioti

Fig. 13 Terminazione della trascrizione mediata dalla proteina rho

Fig. 13 Terminazione della trascrizione mediata dalla proteina rho


Modificazioni post-trascrizionali degli RNA nei batteri

Nei procarioti le molecole di RNA transfer e ribosomiale derivano da un processamento dei trascritti primari (Figura 14).
Queste molecole si originano per azione di specifiche ribonucleasi su un unico trascritto primario di grosse dimensioni molecolari.

Ulteriori modificazioni post-trascrizionali possono riguardare sia le basi azotate che il ribosio.

A differenza degli eucarioti, gli RNA messaggeri dei batteri non subiscono significative modificazioni.

Figura tratta da:
J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochimica, Zanichelli, 6a edizione 2008, traduzione di P.L. Ipata, revisione di E. Melloni, F. Salamino.

Fig. 14 Principali modificazioni post-trascrizionali nei procarioti a carico dei trascritti primari

Fig. 14 Principali modificazioni post-trascrizionali nei procarioti a carico dei trascritti primari


La trascrizione nelle cellule eucariotiche

Negli eucarioti trascrizione e traduzione sono due processi spazialmente e temporalmente separati.
Questo consente una più accurata regolazione del processo di espressione genica (Figura 15).

A livello trascrizionale, la regolazione è controllata da diverse sequenze consenso presenti sui promotori e da numerosi elementi trans (fattori di trascrizione).

A livello post-trascrizionale, gli mRNA eucarioti vanno incontro a estensive modificazioni (maturazione dei trascritti primari).

Figura tratta da:
J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochimica, Zanichelli, 6a edizione 2008, traduzione di P.L. Ipata, revisione di E. Melloni, F. Salamino.

Fig. 15 Trascrizione e traduzione nei procarioti e negli eucarioti

Fig. 15 Trascrizione e traduzione nei procarioti e negli eucarioti


RNA polimerasi eucariotiche

Il nucleo delle cellule eucariotiche contiene almeno tre tipi diversi di RNA polimerasi DNA-dipendenti, tutte proteine omologhe simili alla RNA polimerasi batterica (Figura 16).

Ciascun tipo di RNA polimerasi eucariotica riconosce sul DNA promotori diversi per sequenza e posizione, e sintetizza specifici tipi di RNA (Figura 17).

La RNA polimerasi II è responsabile della trascrizione degli mRNA ed è quindi coinvolta nei processi di espressione genica.

Figure tratte da:
J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochimica, Zanichelli, 6a edizione 2008, traduzione di P.L. Ipata, revisione di E. Melloni, F. Salamino.

Fig. 16 Tipi di RNA polimerasi nelle cellule eucariotiche

Fig. 16 Tipi di RNA polimerasi nelle cellule eucariotiche

Fig. 17 Promotori eucariotici

Fig. 17 Promotori eucariotici


Promotori della RNA polimerasi II

Le sequenze consenso sul promotore della RNA polimerasi II sono localizzati sul versante 5′ rispetto al punto di inizio della trascrizione.

La sequenza più comune è la TATA box, localizzata a -30, molto simile alla sequenza di consenso più comune dei procarioti.

Altri elementi sul promotore importanti per la trascrizione negli eucarioti sono la CAAT box e la GC box, la cui posizione a monte del punto di inizio della trascrizione può essere variabile (Figura 18).

Fig. 18 Promotori della RNA polimerasi II e confronto con i promotori procariotici

Fig. 18 Promotori della RNA polimerasi II e confronto con i promotori procariotici


Fattori di trascrizione

Negli eucarioti sono necessari i fattori di trascrizione, detti elementi trans, che riconoscono determinate sequenze sul DNA.
Durante la trascrizione proteine specifiche vengono reclutate in modo sequenziale.
Si formano complessi macromolecolari sul DNA, essenziali per formare la bolla di trascrizione ed attivare la RNA polimerasi (Figura 19).

La RNA polimerasi II viene coadiuvata da un gruppo di elementi trans noti come TFII, “transcription factors II“, comprendente numerose proteine specifiche.

In genere, l’evento iniziale è il riconoscimento della TATA box ad opera di una “TATA binding protein” (TBP), proteina appartenente alla classe dei TFII.

La TBP è il primo fattore trascrizionale che contatta il DNA.

Figura tratta da:
J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochimica, Zanichelli, 6a edizione 2008, traduzione di P.L. Ipata, revisione di E. Melloni, F. Salamino.

Fig. 19 I fattori di trascrizione formano complessi sul DNA che attivano la RNA polimerasi

Fig. 19 I fattori di trascrizione formano complessi sul DNA che attivano la RNA polimerasi


Fattori di trascrizione e sequenze enhancer

Elementi cis, chiamati enhancer, possono esercitare un’azione stimolatoria sull’attività dei promotori.

Gli enhancer sono localizzati a monte, a valle o addirittura nel gene da trascrivere, a distanza di migliaia di nucleotidi rispetto al punto di inizio della trascrizione.

Gli elementi enhancers sono siti di legame di attivatori, fattori trascrizionali che stimolano la trascrizione.

La cooperazione tra elementi cis sul DNA e fattori trans permette alla RNA polimerasi di accedere a specifici geni, determinando quei meccanismi di selezione dell’espressione genica tipici delle cellule eucariotiche (Figura 20).

Figura tratta da:
J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochimica, Zanichelli, 6a edizione 2008, traduzione di P.L. Ipata, revisione di E. Melloni, F. Salamino.

Fig. 20 Elementi enhancer e attivazione della trascrizione

Fig. 20 Elementi enhancer e attivazione della trascrizione


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