Fosforilazione ossidativa
Tutte le vie metaboliche della degradazione ossidativa dei carboidrati, degli acidi grassi e degli amminoacidi convergono in una tappa finale, in cui l’energia prodotta dalle ossidazioni viene utilizzata per la sintesi di ATP.
La fosforilazione ossidativa è la sintesi di ATP che si verifica in seguito al trasferimento degli elettroni, sottratti durante le ossidazioni, all’ossigeno.
La fosforilazione ossidativa nelle cellule eucariotiche ha luogo nei mitocondri.
I mitocondri
I mitocondri sono organelli cellulari provvisti di doppia membrana (Figura 1).
La membrana esterna è permeabile a piccole molecole e ioni.
Quella interna è permeabile solo a CO2, H2O e O2, essendo impermeabile alla maggior parte delle piccole molecole e degli ioni, compresi i protoni (H+).
Tuttavia, attraverso la membrana interna è possibile il passaggio di specie chimiche aventi specifici trasportatori di membrana.
Lo spazio fra le due membrane è detto spazio intermembrana.
Nella matrice mitocondriale hanno luogo le reazioni di:
- decarbossilazione ossidativa del piruvato;
- ciclo acido citrico;
- ossidazione degli acidi grassi;
- ossidazione degli amminoacidi.
Sulla membrana mitocondriale interna sono localizzati i componenti della catena di trasporto degli elettroni e quelli deputati alla sintesi di ATP.
Fig 1 Un mitocondrio visto al microscopio elettronico
Catena di trasporto degli elettroni
Le reazioni cataboliche determinano la sottrazione di elettroni dalle molecole di substrati ossidate.
Questi elettroni vengono transitoriamente convogliati sui coenzimi specifici (NAD+, NADP+ e FAD) delle varie deidrogenasi.
Gli elettroni legati ai coenzimi NAD+ e FAD sono in seguito trasferiti a specifici trasportatori di elettroni ed infine all’ossigeno, l’accettore finale.
Gli elettroni legati al coenzima NADP+ seguono un altro percorso e vengono utilizzati durante le reazioni anaboliche (biosintesi riduttive).
La catena di trasporto degli elettroni è costituita da una serie di trasportatori di elettroni, la gran parte dei quali sono proteine integrali di membrana, contenenti gruppi prostetici capaci di accettare o donare elettroni.
Nella catena di trasporto degli elettroni sono presenti diversi trasportatori di elettroni, come:
- citocromi;
- proteine ferro-zolfo;
- ubichinone.
Citocromi
I citocromi sono proteine contenenti un gruppo eme.
Vi sono 3 classi di citocromi (a, b, c).
Nei citocromi a e b il gruppo eme è legato alla proteina non covalentemente.
Nei citocromi c il gruppo eme è legato covalentemente a residui di cisteina della proteina.
Nei citocromi b è presente lo stesso gruppo eme della mioglobina e della emoglobina.
Negli altri tipi di citocromi il gruppo eme presenta delle differenze.
I citocromi di tipo a e b, ed alcuni di tipo c, sono proteine integrali della membrana mitocondriale interna.
Un’eccezione è rappresentata dal citocromo c, una proteina solubile che si lega alla superficie esterna della membrana mitocondriale interna.
Nei citocromi l’atomo di ferro del gruppo eme può assumere stati di ossidazione Fe2+ o Fe3+.
I citocromi trasportano elettroni.
Le proteine ferro-zolfo
Le proteine ferro-zolfo contengono ferro associato ad atomi di zolfo [FeS].
Gli atomi di zolfo possono essere residui di cisteina o zolfo inorganico.
Le proteine ferro-zolfo possono avere strutture semplici (un solo atomo di ferro) o complesse (da due a quattro atomi di ferro).
Nelle proteine ferro-zolfo di Rieske, un tipo particolare di proteina ferro-zolfo, l’atomo di ferro è coordinato con 2 residui di istidina invece che con 2 residui di cisteina.
Nelle proteine ferro-zolfo l’atomo di ferro può assumere stati di ossidazione Fe2+ o Fe3+.
Le proteine Fe-S trasportano elettroni.
Nella figura 2 sono rappresentati due esempi di centro Fe-S.
Fig. 2 Esempi di centri Fe-S di proteine ferro-zolfo
Ubichinone (coenzima Q)
L’ubichinone (coenzima Q) è un benzochinone con lunga catena isoprenoide.
Il coenzima Q può accettare un elettrone e un protone (trasformandosi in radicale semichinonico) oppure due elettroni e due protoni (riducendosi completamente a ubichinolo QH2) (Figura 3).
Il coenzima Q è di piccole dimensioni e di natura idrofobica, pertanto può diffondere liberamente nel doppio strato lipidico della membrana mitocondriale interna fungendo da ponte tra i trasportatori di elettroni.
Il coenzima Q trasporta elettroni e protoni.
Fig. 3 L'ubichinone o coenzima Q nei diversi stati di ossidazione.
Catena di trasporto degli elettroni: complesso I
I trasportatori di elettroni sono organizzati in quattro complessi multienzimatici posizionati in maniera ordinata sulla membrana mitocondriale interna (Figura 4).
L’affinità per gli elettroni aumenta dal complesso I fino all’ossigeno.
Ogni complesso è caratterizzato da una propria composizione in proteine e dalla presenza di determinati gruppi prostetici (Figura 5).
Il complesso I (NADH-coenzima Q ossido reduttasi) è costituito da diverse proteine Fe-S e da una flavo proteina contenente FMN.
Questo complesso riceve gli elettroni dal NADH, prodotto durante le reazioni cataboliche, e li cede al coenzima Q.
Il percorso degli elettroni è:
NADH → flavoproteina → proteine Fe-S → coenzima Q.
Al coenzima Q arrivano anche i 2 protoni (del NADH e H+).
Il coenzima Q ridotto (QH2) diffonde nella membrana mitocondriale interna verso il complesso III.
Il trasferimento di elettroni porta contemporaneamente alla fuoriuscita dalla matrice verso lo spazio intermembrana di protoni (H+).
Fig. 4 La catena di trasporto degli elettroni. D.L. Nelson, M.M. Cox, I principi di biochimica di Lehninger, Zanichelli, 4a edizione, 2006, traduzione di P. Capini, E. Regola, revisione di E. Melloni, F. Salamino
Fig. 5 Principali caratteristiche dei complessi di trasporto degli elettroni
Complesso II
Il complesso II (succinato-coenzima Q ossido reduttasi) è di piccole dimensioni e non attraversa completamente la membrana mitocondriale interna.
E’ costituto dall’enzima succinato deidrogenasi del ciclo acido citrico (ossidazione del succinato a fumarato), il cui coenzima è il FAD, da proteine FeS e da un citocromo di tipo b.
Il percorso degli elettroni è:
Succinato → FAD → proteine Fe-S → coenzima Q
Al coenzima Q, oltre che dai complessi I e II, arrivano anche gli elettroni provenienti da altre deidrogenasi, come la acil CoA deidrogenasi (FAD dipendente) della β-ossidazione degli acidi grassi e la glicerolo-3-fosfato deidrogenasi, enzima implicato nel sistema navetta utilizzato per traslocare il NADH citosolico all’interno della matrice mitocondriale.
Il coenzima Q ridotto risultante da tutte queste reazioni diffonde nella membrana mitocondriale interna verso il complesso III.
Complesso III
Il complesso III, detto Coenzima Q citocromo c ossido reduttasi, è costituto da proteine FeS, citocromo b (cit bH, cit bL), citocromo c1.
Il complesso III riceve gli elettroni dal coenzima Q e li trasferisce al citocromo c.
Il percorso degli elettroni è:
coenzima Q → proteine FeS → cit c1 → cit c
Il citocromo c non fa parte del complesso III ma si muove lungo la membrana mitocondriale interna verso il complesso IV.
Il complesso III è un altro sito dove i protoni fuoriescono dalla matrice.
Complesso IV
Il complesso IV (citocromo c ossidasi) è costituto da proteine rame-zolfo (CuA, CuB), citocromo a, citocromo a3.
Il complesso IV riceve gli elettroni dal citocromo c e li trasferisce all’ossigeno che si riduce ad H2O.
Il percorso degli elettroni è:
Cit c → CuA → cit a → cit a3 → CuB → O2
Al trasferimento degli elettroni si associa la fuoriuscita di protoni (H+) dalla matrice verso lo spazio intermembrana.
Flusso di protoni
Per ogni coppia di elettroni trasferita all’ossigeno fuoriescono protoni (H+) dalla matrice verso lo spazio intermembrana.
Poiché la membrana mitocondriale interna è impermeabile ai protoni, questi fuoriescono attraverso i complessi multiproteici I, III e IV.
Vengono trasferiti 4 protoni dal complesso I, 4 dal complesso III e 2 dal complesso IV.
In totale, per ogni coppia di elettroni fuoriescono 10 protoni (Figura 4).
Si genera in questo modo un gradiente di concentrazione protonica tra i due lati della membrana mitocondriale interna, con una concentrazione di protoni più alta nello spazio intermembrana che nella matrice.
Fosforilazione ossidativa
La membrana mitocondriale interna è impermeabile ai protoni e questi rientrano nella matrice attraverso i canali ionici dell’ATP sintasi.
L’ATP sintasi è una proteina di membrana costituita da 2 componenti, F1 e Fo (Figura 6).
Fo attraversa la membrana e consiste di 3 subunità diverse (a, b, c).
F1 sporge nella matrice e consiste di 5 subunità diverse, così organizzate α3β3γδε.
Fo funge da canale proteico per il passaggio di H+.
F1 contiene il sito catalitico per la sintesi di ATP.
Quando i protoni rientrano nella matrice, il flusso di H+ determina un cambio conformazionale dell’ATP-sintasi che rende l’enzima attivo, capace di fosforilare l’ADP ad ATP.
Quindi, l’energia elettrochimica del gradiente protonico fornisce l’energia per la sintesi di ATP da ADP e Pi.
Questa è la teoria chemiosmotica che associa il flusso protonico alla sintesi di ATP (fosforilazione ossidativa).
Fig. 6 Struttura dell'ATP sintasi
Cambi conformazionali nella molecola di ATP sintasi
Le modifiche della conformazione nell’ATP sintasi sono essenziali per la sintesi di ATP.
Nella componente F1 ciascuna delle subunità β possiede un sito catalitico per la sintesi di ATP.
Le subunità β possono assumere tre diverse conformazioni, interconvertibili tra loro:
- Nella conformazione β-ADP la subunità β lega ADP e Pi.
- Nella conformazione β-ATP la subunità β catalizza la sintesi di ATP.
- Nella conformazione β-vuota la subunità β rilascia l’ATP.
In un determinato tempo ogni subunità è in uno dei tre diversi stati conformazionali, di conseguenza le tre subunità β catalizzano a turno la sintesi di ATP.
Sistemi navetta
Il NADH citosolico prodotto nella glicolisi non può attraversare la membrana mitocondriale interna per entrare nella catena di trasporto degli elettroni.
Specifici sistemi navetta trasferiscono gli equivalenti riducenti del NADH citosolico all’interno del mitocondrio.
Il numero di molecole di ATP prodotte dipende dal sistema di trasporto utilizzato.
Sistema navetta del glicerolo fosfato
Il sistema navetta del glicerolo fosfato è attivo nel muscolo e nel cervello.
In questo sistema, il diidrossiacetone fosfato viene ridotto a glicerolo-3-fosfato utilizzando il NADH citosolico prodotto durante la glicolisi (enzima glicerolo-3-fosfato deidrogenasi citosolica).
Successivamente, la glicerolo-3-fosfato deidrogenasi (FAD dipendente) legata al lato esterno della membrana mitocondriale interna ossida il glicerolo-3-fosfato a diidrossiacetone fosfato e trasferisce gli equivalenti riducenti al coenzima Q.
Sistemi navetta (segue)
Sistema navetta del malato-aspartato
Un sistema navetta più complesso e più efficace è quello del malato-aspartato, attivo nei reni, nel fegato e nel cuore.
In questo sistema, l’ossalacetato citosolico viene ridotto a malato utilizzando il NADH citosolico prodotto durante la glicolisi (enzima malato deidrogenasi citosolica).
Il malato attraversa la membrana mitocondriale e nel mitocondrio viene ossidato ad ossalacetato dalla malato deidrogenasi mitocondriale (NAD dipendente).
Il NADH prodotto in questa reazione cede gli elettroni al complesso I della catena di trasporto degli elettroni.
L’ossalacetato è convertito in aspartato (reazione di transaminazione) che attraversa la membrana mitocondriale e nel citosol viene riconvertito in ossalacetato (reazione di transaminazione).
Regolazione della fosforilazione ossidativa
La fosforilazione ossidativa è regolata in modo tale da produrre un numero di molecole di ATP adeguato alle esigenze della cellula.
Il principale regolare è la carica energetica cellulare.
La concentrazione di ADP e il rapporto [ATP]/[ADP]+[P] sono misure dello stato energetico della cellula.
Se la concentrazione di ATP diminuisce → la velocità del trasporto degli elettroni e della fosforilazione ossidativa aumentano.
Se la concentrazione di ATP aumenta → la velocità del trasporto degli elettroni e della fosforilazione ossidativa diminuiscono.
ATP prodotto
Il numero di molecole di ATP prodotte dipende dai protoni che fuoriescono dalla matrice verso lo spazio intermembrana.
I protoni che fuoriescono sono:
- 4 dal complesso I;
- 4 dal complesso III;
- 2 dal complesso IV.
Per ogni coppia di elettroni trasferita dal NADH alla catena di trasporto degli elettroni (complessi I, III, IV) fuoriescono 10 H+.
Per ogni coppia di elettroni trasferita dal FADH2 alla catena di trasporto degli elettroni (complessi III, IV) fuoriescono 6 H+.
4 protoni che rientrano attraverso l’ATP-sintasi producono l’energia per la sintesi di 1 molecola di ATP.
Se il donatore di elettroni è il NADH si producono 2.5 molecole di ATP.
Se il donatore di elettroni è il FADH2 si producono 1.5 molecole di ATP.
Resa totale di ATP
Il numero di molecole di ATP prodotte per molecola di acetil CoA che entra nel ciclo dell’acido citrico è riportato in Figura 7.
Il numero di molecole di ATP prodotte dall’ossidazione completa di una molecola di glucosio è riportato in Figura 8.
Fig. 7 Molecole di ATP prodotte dall'ossidazione di una molecola di acetil-CoA
Fig. 8 Molecole di ATP prodotte durante l'ossidazione completa di una molecola di glucosio
Radicali liberi e stress ossidativo
Durante il normale trasporto degli elettroni l’ossigeno:
- può essere ridotto parzialmente;
- può accettare singoli elettroni.
In tal caso si possono formare derivati instabili, noti come specie reattive dell’ossigeno (ROS), contenenti uno o più elettroni spaiati.
I principali radicali liberi prodotti sono:
- radicale superossido O2-
- perossido di idrogeno H2O2
- radicale ossidrile •OH
- ossigeno singoletto 1O2
Gli antiossidanti proteggono la cellula dai radicali liberi agendo come “scavenger”.
Se in eccesso i radicali liberi possono causare danni alle strutture cellulari:
- lipidi di membrana;
- proteine;
- acidi nucleici.
Le lezioni del Corso
1. Struttura degli amminoacidi e legame peptidico
3. Proteine fibrose e proteine globulari (collageno e mioglobina)
4. Emoglobina e legame all'ossigeno
5. Proprietà generali degli enzimi e cinetica enzimatica
7. Regolazione dell'attività enzimatica
8. Coenzimi
9. Significato generale del metabolismo intermedio
10. Metabolismo dei carboidrati. Glicolisi e destino metabolico del...
12. Trasporto degli elettroni e fosforilazione ossidativa
14. Gluconeogenesi
17. Sintesi degli acidi grassi
18. Metabolismo del colesterolo. Lipoproteine e trasporto dei lipid...
19. Principali reazioni del catabolismo delle proteine. Degradazion...
