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Giovanni Greco » 1.Storia della chemioterapia antinfettiva: dagli organoarsenicali alla penicillina


Il contributo dei farmaci antinfettivi al progresso

La storia delle prime scoperte nel campo degli agenti antinfettivi merita di essere raccontata perché essa racchiude alcuni aspetti della ricerca e dello sviluppo dei farmaci che sono ancora attuali.

I farmaci antinfettivi sono tra quelli che più di altri hanno contribuito a cambiare la qualità e la durata della vita media nei paesi industrializzati.

Alcune malattie infettive responsabili, nel lontano passato, di terribili epidemie (peste, vaiolo, colera) già all’inizio del Novecento non rappresentavano più un problema in Europa grazie al miglioramento graduale delle condizioni di vita nel corso del secolo precedente.
I progressi riguardavano l’alimentazione, la disponibilità di acqua potabile, la pastorizzazione del latte, le vaccinazioni, una maggiore considerazione per l’igiene.

La malattie infettive prima dell’era antibiotica

Agli inizi del Novecento le malattie infettive erano la prima causa di morte. Tubercolosi, polmoniti e infezioni intestinali guidavano la statistica.

In quell’epoca una setticemia significava la morte del paziente nel 30% dei casi e si poteva morire per tubercolosi anche in giovane età.

Oggi si vive mediamente più a lungo.

Le principali cause di morte sono legate a malattie dell’invecchiamento: accidenti cardiovascolari e cancro.

Le malattie infettive nei paesi in via di sviluppo

Le malattie infettive sono di tragica attualità nei paesi in via di sviluppo poiché causano circa 20 milioni di morti all’anno.

In Africa la malaria e l’AIDS sono le malattie infettive più diffuse. Ogni anno si contano 300-400 milioni di nuovi casi di malaria e circa 1 milione di decessi.

Nello stesso continente si stima che esistano 30 milioni di malati di AIDS. La mappa riportata a lato illustra la percentuale di persone affette da HIV nei vari paesi africani (superiore in molti casi al 20%).

Le prime scoperte

L’acido arsanilico o acido p-aminofenilarsenico fu utilizzato come farmaco tra la fine dell’Ottocento e i primi anni del Novecento.
Questa sostanza fu preparata nel 1859 dal biologo francese Antoine Béchamp facendo reagire l’anilina e l’acido arsenico a caldo. Béchamp propose per essa il nome commerciale di Atoxyl riferendosi, troppo ottimisticamente, alla sua ridotta tossicità rispetto all’arsenico inorganico.

L’Atoxyl fu impiegato, come sale monosodico, per trattare alcune infezioni della pelle.
Nel 1905 due medici inglesi, H.W. Thomas and A. Breinl, riportarono che l’Atoxyl era efficace nel trattamento della tripanosomiasi, comunemente nota come “malattia del sonno”. In realtà le dosi di Atoxyl necessarie a curare questa infezione protozoaria risultavano molto tossiche (ad esempio danneggiavano il nervo ottico causando frequentemente cecità) per cui questo farmaco cadde in disuso.

Acido arsanilico.

Acido arsanilico.


Il metodo di Herlich

Paul Ehrlich, assistito da Alfred Bertheim, rivolse la sua attenzione allo studio chimico e farmacologico dell’Atoxyl. Questi due ricercatori chiarirono la struttura dell’acido arsanilico. Successivamente si dedicarono alla preparazione e alla valutazione di derivati organoarsenicali simili all’Atoxyl nella speranza di trovarne qualcuno efficace e sicuro per l’uso sistemico. Nel 1909, nel corso di ricerche condotte in collaborazione con Sahachiro Hata, Ehrlich scoprì che uno dei suoi composti che stava esaminando (contrassegnato dalla sigla 606 e corrispondente all’arsfenamina) era efficace nel trattamento del Treponema pallidum, la spirocheta agente eziologico della sifilide. Nel 1910 l’arsfenamina fu commercializzata con il nome di Salvarsan.
Nel 1912 un nuovo organoarsenicale contrassegnato dalla sigla 914, la neorsfenamina, rimpiazzò il Salvarsan con il nome brevettato di Neosalvarsan.

Il grande merito di Herlich fu quello di adottare un metodo sistematico di ricerca che consisteva nell’analizzare uno per uno i derivati di uno stesso composto di riferimento. Questo approccio all’ottimizzazione di un composto guida conserva ancora oggi la sua validità.

Arsefenamina …

Herlich riteneva che la struttura dell’arsfenamina fosse quella di un dimero caratterizzato da un doppio legame tra due atomi di arsenico trivalente.
Studi cristallografici, pubblicati nel 2005, hanno dimostrato che l’arsfenamina è in realtà una miscela composta da un trimero e da un pentamero in cui i legami tra gli atomi di arsenico sono singoli e non doppi.

In figura: strutture della arsfenamina dimerica (in alto), trimerica (al centro) e pentamerica (in basso).

Strutture della arsfenamina dimerica (in alto), trimerica (al centro) e pentamerica (in basso)

Strutture della arsfenamina dimerica (in alto), trimerica (al centro) e pentamerica (in basso)


… e neoarsfenamina

La neoarsfenamina differisce dall’arsfenamina per la presenza di una funzione metansolfinica sull’azoto anilinico. Il farmaco veniva impiegato sottoforma di sale sodico.
Sia il salvarsan che il neosalvarsan erano associati a pesanti effetti collaterali. Tuttavia, in quegli anni gli organoarsenicali erano gli unici farmaci a disposizione del medico per curare la sifilide.
L’avvento dei sulfamidici negli anni Trenta non modificò la situazione poiché questa classe di antibatterici non è attiva nei confronti del Treponema pallidum.
La vera svolta nella terapia della sifilide fu rappresentata, negli anni Quaranta, dalla penicillina G.

In figura: la neoarsfenamina è una variante dell’arsefanamina salificata e più solubile in acqua.

La Neoarsfenamina è una variante dell’arsefanamina salificata e più solubile in acqua.

La Neoarsfenamina è una variante dell'arsefanamina salificata e più solubile in acqua.


Il proiettile magico

Ehrlich coniò il termine “chemioterapia”. Egli, inoltre, introdusse il concetto del “proiettile magico”, cioè a dire un farmaco antinfettivo di basso peso molecolare che attacca in maniera selettiva l’organismo responsabile della malattia, senza danneggiare l’ospite.

Ehlrich perseguì questo obiettivo senza mai raggiungerlo. I suoi composti organoarsenicali erano ancora troppo poco maneggevoli.

Per disporre di veri proiettili magici i medici dovranno attendere la commercializzazione del primo sulfamidico, le sulfamidocrisoidina, nel 1935.

Dai coloranti dei batteri ai farmaci antibatterici

Nel 1909 alcuni ricercatori della Farbeindustrie, a Wuppertal-Elberfeld (Germania) cominciarono a lavorare su azocoloranti contenenti gruppi solfonamidici quali potenziali farmaci antibatterici.
Il razionale di questo progetto era che se i coloranti si fissavano alle fibre proteiche (seta, lana) avrebbero potuto fissarsi anche alle cellule batteriche.
Questa ipotesi di lavoro poggiava sull’esperienza del metodo Gram di colorazione dei vari batteri in cui si utilizza il colorante cristal-violetto.
Per molti anni le ricerche di azocoloranti antibatterici non produssero risultati di rilievo.

La Farbeneindustrie all’inzio del Novecento è una fabbrica di coloranti. Successivamente si trasformerà nella Bayer.

Il Prontosil Rubrum

Nel 1927 il lavoro presso la Farbeneindustrie continuò con una squadra formata da due chimici (Fritz Mietzch e Joseph Klarer) e da un farmacologo Gerhard Domagk.

Nel 1932 questi ricercatori prepararono la sulfamidicrisoidina, contrassegnata dalla sigla D4145. Questo preparato, di colore rosso, si rivelò attivo in vivo (nelle infezioni sperimentali da streptococco emolitico nel topo) ma inattiva in vitro nei saggi microbiologici sullo stesso ceppo batterico.
La sulfamidocrisoidina fu commercializzata nel 1935 col nome di Prontosil rubrum. Grazie a questo farmaco, le possibilità di curare malattie infettive quali la meningite, la polmonite, le infezioni urinarie, aumentarono vistosamente. Per la prima volta nella storia i medici potevano somministrare un farmaco efficace e maneggevole per la cura di infezioni sistemiche.

Nel 1935 Domagk fu insignito del premio Nobel per la medicina quale riconoscimento per la scoperta dei sulfamidici. Dato che il regime nazista aveva boicottato la commissione dei premi Nobel, Hitler impedì a Domagk di recarsi a Stoccolma per la premiazione. Solo dopo la fine della guerra Domagk poté ritirare il suo premio.

Sulfamidocrisoina.

Sulfamidocrisoina.


Dal prontosil Rubrum al Prontosil Album

Presso l’Istituto Pasteur di Parigi, un gruppo di ricercatori (Daniel Bovet, Ernest Forneau, Jacques Tréfouël, Federico Nitti) scoprì nel 1935 che il Prontosil Rubrum veniva scisso nell’organismo per azo riduzione. Questa biotrasformazione dava origine alla sulfanilamide e al 1,2,4-triaminobenzene. Dei due metaboliti solo la sulfanilamide risultava attiva come antibatterico sia in vivo che in vitro.

La sulfanilamide fu commercializzata successivamente col nome brevettato di Prontosil album.

Con questa scoperta fu dato il via ad un programma di sintesi di composti basati sulla struttura della sulfanilamide, che produsse numerosi composti attivi, alcuni dei quali sono usati ancora oggi.

La sulfamidicrisoidina libera in vivo la sulfanilamide.

La sulfamidicrisoidina libera in vivo la sulfanilamide.


Quasi 30 anni per “riscoprire” la sulfanilamide

In realtà la sulfanilamide era stata sintetizzata molti anni prima, nel 1908, da Paul Gelmo, uno studente di chimica presso l’Università di Vienna.

Fino alla scoperta della biotrasformazione della sulfamidocrisoidina nel 1936 le potenzialità della sulfanilamide erano rimaste ignote!

Questa sostanza poté essere identificata come farmaco antibatterico solo dopo essere stata impiegata come materia prima, incolore, nella sintesi degli azocoloranti.
Bisogna tener conto che i progetti di ricerca incentrati sui coloranti azoici erano basati sul presupposto che gli agenti antibatterici dovessero essere colorati e la sulfanilamide era incolore.

La scoperta casuale della penicillina

Nel periodo in cui i sulfamidici entravano nella pratica terapeutica, l’era degli antibiotici era ancora allo stato latente.

Il batteriologo inglese Alexander Fleming aveva osservato nel 1928 che una muffa blu aveva parzialmente invaso un disco di Petri e aveva causato la lisi delle colonie preesistenti di stafilococchi.

Fleming aveva provato sperimentalmente che la muffa, costituita da Penicillum notatum, produceva un principio attivo con proprietà antibatteriche e non tossica per gli animali che chiamò penicillina.

I primi esperimenti con la penicillina

L’impiego della penicillina per la cura di alcune infezioni batteriche non venne preso seriamente in considerazione per oltre un decennio data l’estrema difficoltà di ottenere quantità adeguate di questo antibiotico

All’inizio del 1940, i chimici inglesi Howard W. Floerey e Ernst B. Chain cercarono di produrre l’antibiotico in quantitativi sufficienti per la sperimentazione.

La procedura di estrazione della penicillina era molto laboriosa. Occorreva aspettare giorni e giorni perché la muffa crescesse e molti altri per ricavare dalle colture un magro bottino: poco più di 500 litri di brodo di coltura fornivano una fanghiglia che conteneva appena il 2% di penicillina.

Il 25 maggio del 1940 Florey realizzò il primo esperimento decisivo. Inoculò a otto topi lo Streptococcus pyogenes e somministrò a quattro di essi l’estratto contenente penicillina. Solo i topi trattati con l’antibiotico sopravvissero alla setticemia.

I primi esperimenti con la penicillina

Florey e Chain, con l’aiuto di un loro collega biochimico Edward Abraham, prepararono ulteriori quantitativi di penicillina per provare la sua efficacia sull’uomo.

Il primo paziente fu un poliziotto di Oxford che si era infettato graffiandosi le labbra con le spine di un roseto. L’infezione lo aveva aggredito in tutto il corpo in modo apparentemente irreversibile.

Dopo aver somministrato la prima dose ci si rese conto che il farmaco funzionava ma le quantità erano insufficienti per proseguire la terapia. La penicillina fu allora recuperata e isolata dalle urine del paziente.
La terapia continuò per alcuni giorni ma le dosi si rivelarono comunque insufficienti e il paziente morì.

I ricercatori compresero che la penicillina era efficace sull’uomo. Altri esperimenti su una decina di volontari, condotti con sufficienti quantitativi di penicillina, furono completati con successo. Nel 1941 comparve il primo articolo sulla rivista “The Lancet” che descriveva le proprietà dell’antibiotico.

La produzione industriale della penicillina G

Riconosciuta la sua utilità, numerose aziende farmaceutiche del Regno Unito ne intrapresero la produzione.

Tuttavia, il quantitativo limitato ottenibile con questo procedimento indusse Florey, Chain e Abraham a recarsi negli Stati Uniti per coinvolgere anche aziende farmaceutiche americane nella produzione della sostanza.

I ricercatori lavorarono presso la Pfizer, un’azienda chimica di Brooklyn, che adattò alla penicillina G il processo di fermentazione della melassa usato per la produzione dell’acido citrico.

Nel 1943 la Pfizer riusciva a produrre grandi quantitativi di penicillina G da ceppi di Penicillium crhysogenum, che vennero largamente utilizzati durante la guerra per curare i soldati feriti.

La struttura della penicillina G

La struttura della penicillina G per molti anni rimase un mistero a causa della presenza dell’inconsueto anello β-lattamico.

Il mistero fu chiarito solo nel 1949, grazie ad esperimenti di cristallografia ai raggi-X condotti da Dorothy C. Hodgkin presso l’Università di Cambridge.

Grazie alla conoscenza della struttura tridimensionale della penicillina G, i chimici farmaceutici riuscirono a preparare dei suoi analoghi dotati di caratteristiche migliori riguardo allo spettro d’azione e alla possibilità di somministrazione orale.
Gli antibiotici β-lattamici semisintetici rappresentano attualmente la classe più importante di farmaci antibatterici.

Struttura tridimensionale della penicillina G.

Struttura tridimensionale della penicillina G.


Comincia l’era degli antibiotici

Dopo l’introduzione in commercio della penicillina G, lo screening di decine di migliaia di microrganismi condusse nel gioro di pochi anni alla scoperta di un certo numero di antibiotici:

  • streptomicina nel 1994
  • cloramfenicolo nel 1947
  • clortetraciclina nel 1948
  • cefalosporina C nel 1948
  • neomicina nel 1949
  • nistatina nel 1950
  • eritromicina nel 1952

Ciascuno di questi antibiotici “naturali” divenne il composto di riferimento per la preparazione di antibiotici semisintetici.

L’uso massiccio ed indiscriminato degli antibiotici ha ridotto gran parte del loro potenziale a causa della comparsa di ceppi batterici divenuti resistenti alla loro azione.
La storia degli antibiotici continua. Oltre alla necessità di nuovi antibiotici, occorre usare quelli disponibili in maniera mirata.

I materiali di supporto della lezione

Consultare il capitolo “La penicillina: addio ai batteri” dal libro: Stefano Cagliano, Dieci farmaci che sconvolsero il mondo, La Terza,

1994, Bari.

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