Vai alla Home Page About me Courseware Federica Living Library Federica Federica Podstudio Virtual Campus 3D Le Miniguide all'orientamento Gli eBook di Federica La Corte in Rete
 
I corsi di Farmacia
 
Il Corso Le lezioni del Corso La Cattedra
 
Materiali di approfondimento Risorse Web Il Podcast di questa lezione

Alfonso Mangoni » 11.Spettrometria di massa – 5 – Sorgenti FAB, Electrospray, MALDI


Limiti della sorgente EI

La sorgente EI ha due tipi di problemi.

Non si può usare se il composto non è sufficientemente volatile.

Possibili rimedi: derivatizzazione (zuccheri e composti poliossidrilati; acidi carbossilici).

Lo ione molecolare non è visibile se la frammentazione è eccessiva.

Possibili rimedi: Energia di ionizzazione più bassa di 70 eV

Se ci sono questi problemi, è spesso meglio usare un altro tipo di sorgente.

La derivatizzazioni di alcoli e acidi carbossilici rende i composti più volatili

La derivatizzazioni di alcoli e acidi carbossilici rende i composti più volatili

La diminuzione dell’energia di ionizzazione rende lo ione molecolare più intenso

La diminuzione dell'energia di ionizzazione rende lo ione molecolare più intenso


Sorgente FAB (Fast Atom Bombardment)

Il campione è sciolto in una matrice (solvente protico e poco volatile: glicerolo, 1-tioglicerolo, alcol 3-nitrobenzilico, trietanolammina).

La soluzione è investita da un flusso di atomi di Xe (o ioni Cs+) ad alta energia cinetica, che provocano la volatilizzazione.

La ionizzazione è dovuta a reazioni acido-base prima e durante questo processo.

Si formano ioni pseudomolecolari [M+H]+ (FAB+) e [M–H] (FAB–).

Schema della sorgente FAB

Schema della sorgente FAB

Alcune matrici per il FAB

Alcune matrici per il FAB


Sorgente FAB (Fast Atom Bombardment)

Schema della sorgente FAB

Schema della sorgente FAB


Sorgente FAB (Fast Atom Bombardment)

  • Il FAB è adatto a molecole polari, che possono subire reazioni acido-base: glicosidi, peptidi, oligonucleotidi, alcaloidi. Oggi è spesso sostituito alla sorgente electrospray.
  • Lo spettro FAB forma ioni stabili: lo ione molecolare è sempre visibile ed intenso, ma sono spesso visibili anche picchi di frammentazione (soprattutto per molecola grandi) che possono dare utili informazioni strutturali.
  • Oltre allo ione pseuomolecolare [M+H]+, nel FAB+ sono spesso visibili ioni del tipo [M+Na]+ e [M+K]+, dovute all’addizione alla molecola di uno ione Na+ o K+ invece che di un protone.

Sorgente FAB (Fast Atom Bombardment)

  • Un problema del FAB è l’elevato rumore di fondo: anche la matrice (S) ionizza e dà luogo ad un intenso picco [S+H]+, e anche picchi del tipo [2S+H]+, [3S+H]+, [4S+H]+, [5S+H]+ (m/z 93, 185, 277, 369, 461, ecc per la glicerina).
  • Si possono incontrare problemi con sostanze con peso molecolare al di sotto di 400, poiché al di sotto di questo valore il rumore di fondo è molto elevato.
  • Il limite superiore dipende essenzialmente dalla capacità dell’analizzatore, ma anche con analizzatori adatti si nota comunque una perdita di sensibilità nella ionizzazione di molecole con massa elevata.

Esempi di spettri FAB

Nelle figure sono mostrati due tipici spettri FAB.

Si può osservare che è stato possibile ottenere lo spettro di massa di un peptide, che è assolutamente non volatile e quindi non analizzabile con la sorgente EI.

Si vede anche che lo ione molecolare è sempre ben evidente, ma ci sono anche dei picchi di frammentazione.

Un tipico spettro FAB+

Un tipico spettro FAB+

Spettro FAB− di un peptide

Spettro FAB− di un peptide


Uno strumento FAB/magnetico

Spaccato di uno spettrometro di massa con analizzatore magnetico e sorgente FAB.

Spaccato di uno spettrometro di massa con analizzatore magnetico e sorgente FAB.


L’electrospray (ESI)

L’electrospray (o ESI) è la sorgente al momento più diffusa.

Il campione è sciolto in un solvente volatile protico (miscele di acqua e MeOH, di acqua e acetonitrile, MeOH), con eventuale aggiunta di acidi organici (formico, trifluoroacetico) e/o tamponi.

La soluzione passa per un ago capillare con un forte potenziale positivo (3-4 kV), e forma uno spray di goccioline con eccesso di carica positiva.

Principio di funzionamento dell’electrospray: formazione dello spray

Principio di funzionamento dell'electrospray: formazione dello spray


L’electrospray (ESI)

La carica positiva delle goccioline è data da un eccesso di ioni H+.

All’interno delle goccioline, le molecole vengono protonate, e nel frattempo il solvente evapora e la densità di carica della gocciolina aumenta.

Alla fine gli ioni vengono espulsi dalla superficie della gocciolina per repulsione elettrostatica.

Se l’ago ha potenziale negativo si formano, in maniera analoga, ioni negativi.

Principio di funzionamento dell’electrospray: formazione degli ioni

Principio di funzionamento dell'electrospray: formazione degli ioni


L’electrospray (ESI)

Il processo descritto avviene a pressione atmosferica, quindi all’esterno della zona ad alto vuoto dello spettrometro.

Gli ioni che si formano entrano nello spettrometro attraverso una serie di fenditure fino ad arrivare nella zona a bassa pressione dello spettrometro di massa, dove sono accelerate ed inviate all’analizzatore.

Schema della sorgente electrospray

Schema della sorgente electrospray


Ioni multicarica

Se la molecola ha molti siti protonabili, la sorgente electrospray genera ioni a carica multipla. Nel caso di peptidi grandi e proteine, si possono ottenere ioni con decine di cariche.

Questo è importante perché abbassa il rapporto m/z degli ioni, permettendo di analizzare ioni anche molto pesanti con analizzatori standard.

A parità di peso molecolare, ioni a carica multipla hanno un rapporto m/z minore

A parità di peso molecolare, ioni a carica multipla hanno un rapporto m/z minore


Ioni multicarica

Quando si formano ioni a carica multipla, non tutti gli ioni generati hanno lo stesso numero di cariche.

Se il composto ha massa molto grande (come in questo spettro del citocromo C) si formano molti tipi di ioni e lo spettro può presentare molti picchi.

Spettro di massa ESI del citocromo C, MW ≈ 15900

Spettro di massa ESI del citocromo C, MW ≈ 15900


Ioni multicarica

In quest’altro caso una proteina più piccola (il lisozima, MW ≈ 14300) genera solo quattro ioni diversi (in alto).

Ma il numero e tipo di picchi dipende anche dallo spettrometro e dal solvente usati (qui una miscela 1:1 di acetonitrile e di 0.1% HCOOH in H2O). Ecco un altro spettro del lisozima (in basso), piuttosto diverso dal precedente: ma le informazioni che ne ricaviamo sono identiche.

Spettro di massa ESI del lisozima

Spettro di massa ESI del lisozima

Spettro di massa ESI del lisozima

Spettro di massa ESI del lisozima


Deteminazione della massa molecolare

Quando gli ioni prodotti dalla sorgente ESI hanno più di una carica, bisogna conoscere il numero di cariche z per calcolare la massa m dal rapporto m/z misurato.

È ovvio che la carica di due picchi vicini differisce di una unità: quindi, per due picchi contigui, m è lo stesso, mentre z differisce di 1.

Si hanno due equazioni e due incognite (m e z1), si può quindi calcolare m.

Due picchi contigui hanno carica differente di 1, e quindi z2 = z1 + 1

Due picchi contigui hanno carica differente di 1, e quindi z2 = z1 + 1

Risolvendo questo sistema si calcola m

Risolvendo questo sistema si calcola m


Caratteristiche della sorgente electrospray

L’electrospray è una sorgente adatta alla maggior parte dei composti, dalle piccole molecole organiche (anche non volatili) fino a macromolecole come proteine (purché esse abbiano disponibili molti siti ionizzabili). Solo composti estremamente apolari come gli idrocarburi non sono analizzabili.

La sensibilità dell’electrospray non diminuisce sostanzialmente all’aumentare della massa della sostanza analizzata.

I solventi volatili usati nell’ESI non danno picchi come quelli dati dalla matrice nel FAB, per cui il rumore di fondo è molto basso.

Caratteristiche della sorgente electrospray

L’electrospray generalmente produce solo ioni pseudomolecolari; in qualche caso è possibile osservare anche ioni frammento, ed in alcuni spettrometri è anche possibile favorire la frammentazione in sorgente agendo sulle condizioni sperimentali.

La presenza di metalli alcalini non è particolarmente fastidiosa per l’analisi di piccole molecole organiche: come nel FAB, si formano ioni [M+Na]+ e [M+K]+. È invece molto dannosa per ioni poliprotonati: infatti se uno o più Na+ sostituiscono gli H+, si formano ioni aggiuntivi che complicano lo spettro e riducono la sensibilità.

Sorgente electrospray

Una sorgente electrospray

Una sorgente electrospray


La sorgente MALDI

MALDI è l’acronimo di Matrix Assisted Laser Desorption Ionization. La ionizzazione della molecola da analizzare è indotta da un brevissimo (dell’ordine dei ns) ma intenso impulso di luce laser ultravioletta.

Per essere efficace, la radiazione ultravioletta deve essere assorbita, per cui il campione è cocristallizzato con una matrice solida che assorbe alla lunghezza d’onda (337 nm) prodotta da un laser ad azoto.

L’impulso è concentrato su una superficie di pochi μm2, e con un microscopio si può scegliere il punto esatto del cristallo su cui mandare l’impulso laser.

La sorgente MALDI

Il campione assorbe l’energia dell’impulso laser e la cede alla molecola, che viene così ionizzata e volatilizzata. Si formano ioni pseudomolecolari a singola carica positivi e negativi.

Il MALDI è una tecnica di ionizzazione “soft” e ionizza bene sia piccole molecole che macromolecole senza provocare frammentazione.

Principio di funzionamento del MALDI

Principio di funzionamento del MALDI


Preparazione del campione

Le matrici più usate sono il DHB, l’acido sinapinico e l’HCCA.

Il campione è preparato sciogliendo l’analita e la matrice in un solvente organico volatile.

Una goccia (1 μL o meno) della soluzione è posta su uno dei pozzetti del target (una piastra di acciaio) e lasciata evaporare.

La matrice cristallizza formando una soluzione solida con l’analita.

Le matrici più comuni per il MALDI

Le matrici più comuni per il MALDI

Il target

Il target


Analizzatore per il MALDI

La sorgente MALDI è quindi una sorgente ad impulsi, cioè non genera un flusso continuo di ioni, ma una grande quantità di ioni tutti in una volta.

Una sorgente del genere non può essere usata con analizzatori come quello magnetico, che funzionano da filtri, perché questo richiedono un flusso continuo di ioni.

Si una invece un altro tipo di analizzatore, l’analizzatore a tempo di volo (detto anche TOF = time of flight), che sarà descritto nella prossima lezione.

  • Contenuti protetti da Creative Commons
  • Feed RSS
  • Condividi su FriendFeed
  • Condividi su Facebook
  • Segnala su Twitter
  • Condividi su LinkedIn
Progetto "Campus Virtuale" dell'Università degli Studi di Napoli Federico II, realizzato con il cofinanziamento dell'Unione europea. Asse V - Società dell'informazione - Obiettivo Operativo 5.1 e-Government ed e-Inclusion