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Domenico Pirozzi » 12.Produzione di penicillina


Antibiotici

Gli antibiotici sono sostanze chimiche prodotte da microorganismi, che anche a bassa concentrazione esplicano un’azione inibitrice su sistemi biologici.
Si distinguono in:

  • batteriostatici, che bloccano la riproduzione del batterio, impedendone la scissione
  • battericidi, che uccidono il microrganismo
Tabella 1 – Classificazione degli antibiotici in base al meccanismo di reazione.

Tabella 1 – Classificazione degli antibiotici in base al meccanismo di reazione.


Penicilline

Le penicilline, come tutti gli altri antibiotici, sono metaboliti secondari. Sono normalmente prodotte da diversi batteri e funghi del genere Penicillium.
I Penicillium chrysogenum, la specie usata per la produzione industriale di penicillina, sono organismi pluricellulari, in grado di formare ife (serie filiformi e ramificate di cellule) e miceli (ammassi intricati di ife simili ad un tessuto).

Il meccanismo di azione delle penicilline è basato sull’inibizione dell’enzima transpeptidasi. La transpeptidasi contribuisce alla rigidità delle pareti cellulari dei batteri (che sono costituite da peptidoglicani), catalizzando la formazione di legami peptidici tra i residui aminoacidici dei peptidoglicani. Di conseguenza, le penicilline inibiscono la sintesi delle pareti cellulari, e dunque la crescita batterica.

Penicilline

Le penicilline sono prodotte per acilazione dell’acido 6-aminopenicillanico (6-APA), che ne è il precursore chimico.

La penicillina G (benzil-penicillina) si ottiene per aiclazione del 6-APA, utilizzando acido fenilacetico come agente acilante (Figura 1). Tra le penicilline naturali, la penicillina G è quella prodotta in maggior quantità, ed è anche la più stabile.

Figura 1 – Reazione di acilazione dell’acido 6-aminopenicillanico (6-APA) con l’acido fenilacetico, con produzione di penicillina G ed acqua. L’anello a 5 atomi è caratteristico del β-lattami.

Figura 1 – Reazione di acilazione dell'acido 6-aminopenicillanico (6-APA) con l'acido fenilacetico, con produzione di penicillina G ed acqua. L'anello a 5 atomi è caratteristico del β-lattami.


Penicilline

Tutte le penicilline sono N-acilderivati dell’acido 6-amminopenicillico, e dunque si ottengono per acilazione dell’acido 6-aminopenicillanico (6-APA) con diversi agenti acilanti (Figura 2).

Figura 2 – Struttura chimica della penicillina F e della penicillina X.

Figura 2 – Struttura chimica della penicillina F e della penicillina X.


Storia delle penicilline

1877 – Pasteur scopre fenomeni di antagonismo, intuendone il potenziale terapeutico.

1929 – Fleming osserva l’inibizione della crescita batterica in presenza di una coltura di Penicillium, e dimostra la produzione di una sostanza antibatterica (penicillina).

1938 – Florey e Chain riprendono le ricerche di Fleming, dimostrando il potenziale terapeutico della penicillina.

1943 – Il processo fermentativo viene definitivamente preferito alla sintesi chimica.

1950 – Produzione di antibiotici semisintetici.

Figura 3 –Alone di inibizione della crescita batterica dovuto alla produzione di penicillina dal fungo Penicillium.

Figura 3 –Alone di inibizione della crescita batterica dovuto alla produzione di penicillina dal fungo Penicillium.


Evoluzione del processo

Nel 1939, la concentrazione di penicillina ottenuta al termine del ciclo fermentativo dei Penicillium chrysogenum era pari a ca. 0,001 g/L.

Nel 2000, grazie ai miglioramenti apportati al processo, la concentrazione ottenuta era pari a ca. 50 g/L.

I miglioramenti conseguiti sono dovuti ad un approccio multidisciplinare.

Ingegneria genetica

  • Mutagenesi con raggi X e UV, associata alla continua selezione di mutanti ad alta produttività
  • Manipolazione mirata del DNA dei microorganismi produttori

Ingegneria metabolica

  • Minimizzazione dell’inibizione feedback causata dalla lisina e della repressione catabolica

Condizioni operative e configurazione reattoristica

Biosintesi della penicillina

La biosintesi della penicillina trae origine dall’α-ketoglutarato, uno degli intermedi del ciclo di Krebs.

Il ciclo metabolico successivo è condizionato da fenomeni di inibizione e repressione di alcuni enzimi. Lo studio approfondito di questi fenomeni ha contribuito in maniera determinante ad aumentare l’efficienza del processo industriale di produzione della penicillina.

Inibizione Feedback prodotta dalla Lisina – La lisina inibisce l’enzima omocitrato sintetasi, che catalizza la formazione dell’omocitrato.

Repressione catabolica – Diversi zuccheri, tra cui il glucosio, reprimono alcuni tra gli enzimi coinvolti nella biosintesi della penicillina. Di conseguenza, la biosintesi della penicillina non ha luogo in maniera apprezzabile finché c’è un eccesso di fonti carbonio.

Figura 5 – Biosintesi della penicillina.

Figura 5 – Biosintesi della penicillina.


Ciclo produttivo della penicillina

La penicillina è un metabolita secondario,e la sua produzione ha luogo in misura apprezzabile solamente dopo che la crescita della biomassa si è arrestata (Figura 6).

Essendo la penicillina un metabolita secondario, la fase di produzione della biomassa (fase di crescita) viene realizzata separatamente dalla fase di produzione della penicillina (fase stazionaria).

Figura 4 – Profili concentrazione-tempo di un  metabolita primario e di un metabolita secondario.

Figura 4 – Profili concentrazione-tempo di un metabolita primario e di un metabolita secondario.


Fase di crescita

La fase di crescita è finalizzata alla produzione di biomassa. Viene effettuata in reattori batch con gorgogliamento di ossigeno ed efficace sistema di miscelazione.

Il terreno di coltura può contenere acque di macerazione del mais, ricche di aminoacidi, sali minerali, vitamine e con un elevato contenuto di zuccheri, per consentire una rapida crescita della biomassa.

In genere vengono aggiunti aminoacidi (per accelerare la crescita della biomassa) ed acido fenilacetico (per favorire la formazione di penicillina G, della cui catena laterale è precursore).

La concentrazione finale di biomassa non deve essere troppo elevata, per evitare, nella successiva fase stazionaria, un eccessivo consumo di ossigeno per unità di volume, che renderebbe difficile il mantenimento di condizioni effettivamente aerobiche in ogni punto del reattore.

Fase stazionaria

La fase stazionaria è finalizzata alla sintesi della penicillina, con limitata crescita della biomassa.

Il reattore già impiegato per la fase di crescita viene impiegato come fed-batch, con alimentazione progressiva di zuccheri, in modo da mantenerne bassa la concentrazione e limitare così la repressione catabolica.

Nel reattore si continua ad alimentare ossigeno. Purtroppo i microorganismi filamentosi aumentano la viscosità del terreno di coltura, rallentando la diffusione dell’ossigeno, e rendendo più costosa la miscelazione. Il mantenimento di un’elevata concentrazione di ossigeno richiede un efficace sistema di miscelazione, e l’impiego di agenti antischiuma (la schiuma rallenta il trasporto di O2).

In genere la fermentazione prevede cicli produttivi piuttosto lunghi (ca. 2 settimane).

Figura 6 – Profili concentrazione-tempo nel corso della pre-fermentazione e della fermentazione della penicillina.

Figura 6 – Profili concentrazione-tempo nel corso della pre-fermentazione e della fermentazione della penicillina.


Selezione del bioreattore per la fase di fermentazione

Bioreattori batch
Non ottimali, in quanto la durata dei cicli produttivi sarebbe limitata, e dunque l’incidenza dei tempi morti alta.
Infatti, i cicli produttivi potrebbero essere allungati aumentando le concentrazioni iniziali di zucchero, ma ciò è impedito dall’esigenza di evitare repressione catabolita.

Bioreattori CSTB
Consentirebbero di evitare la repressione catabolita, in quanto è possibile mantenere condizioni di regime stazionario a bassa concentrazione di zuccheri.

Tuttavia, la ridotta velocità di crescita della biomassa determinerebbe un valore molto basso della portata di wash-out, e di conseguenza una produttività insoddisfacente.

Inoltre, la pre-fermentazione in continuo richiederebbe un reattore separato.

Sarebbe infine problematico effettuare la separazione finale del prodotto in continuo.

Selezione del bioreattore per la fase di fermentazione

Bioreattori fed-batch

Consentono di evitare la repressione catabolita, in quanto l’alimentazione progressiva di zuccheri consente di mantenere per un tempo prolungato una concentrazione sufficientemente bassa di zuccheri.

I cicli produttivi sono abbastanza lunghi da rendere trascurabile l’incidenza dei tempi morti, e possono essere realizzati nello stesso reattore in cui ha luogo la pre-fermentazione.

Downstream

Fasi del recupero della penicillina

  • Filtrazione per separare la biomassa dal terreno di coltura
  • Essiccazione del terreno di coltura, mediante spray drying per limitare l’esposizione ad alte temperatura (la penicillina è piuttosto instabile)
  • Estrazione con solventi (butil acetato per la penicillina G)
  • Precipitazione frazionata con aggiunta di basi organiche che formano sali poco solubili con penicillina G
  • Sterilizzazione mediante filtrazione, per limitare l’esposizione a temperatura alta

Downstream (segue)

Smaltimento dei reflui del processo

La produzione della penicillina genera notevoli quantità di residui per la bassa percentuale di prodotto utile.

La presenza di antibiotico ne rende problematico lo smaltimento. Di conseguenza, si effettua un trattamento preliminare per rimuovere la penicillina. Sono due i metodi più diffusi:

  • acidificazione seguita dall’essiccazione ad alta temperatura per decomporre la penicillina (alto consumo di energia)
  • trattamenti biologici con microrganismi resistenti all’antibiotico

Il prodotto così ottenuto viene utilizzato come integratore per mangimi animali o fertilizzante, oppure viene smaltito con metodi tradizionali.

Limiti delle penicilline naturali

L’efficacia delle penicilline naturali è limitata dall’insorgenza di fenomeni di resistenza nei ceppi batterici patogeni, e da altri fattori che ne influenzano l’applicabilità:

  • sono inefficaci contro i batteri Gram-, che possiedono all’esterno della parete cellulare una membrana impermeabile alla penicillina
  • sono soggette ad idrolisi (enzima penicillina-acilasi)
  • sono instabili in ambiente acido

Gli ultimi due fattori rendono impossibile la somministrazione per via orale.

Penicilline semisintetiche e biosintetiche

Le penicilline semisintetiche consentono di superare i limiti delle penicilline naturali.

Vengono prodotte utilizzando la penicillina G, che viene sottoposta ad una doppia trasformazione:

L’idrolisi della penicillina G, catalizzata dall’enzima penicillin-acilasi in fase acquosa, con produzione di 6-APA.

L’acilazione del 6-APA con un opportuno agente acilante, catalizzata da penicillin-acilasi in solvente organico (in ambiente non acquoso, per spostare l’equilibrio verso il prodotto di sintesi).

Un’alternativa alle penicilline semisintetiche è rappresentata dalle penicilline biosintetiche, che vengono prodotte mediante fermentazione, aggiungendo al terreno di coltura un agente acilante tale da favorire la produzione della penicillina desiderata.

Figura 7 – Struttura chimica di due penicilline semisintetiche: ampicillina e meticillina.

Figura 7 – Struttura chimica di due penicilline semisintetiche: ampicillina e meticillina.

Tabella 2 – Alcune proprietà dell’ampicillina e della meticillina.

Tabella 2 – Alcune proprietà dell'ampicillina e della meticillina.


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