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Franca Esposito » 8.Biosegnalazione


Biosegnalazione

La biosegnalazione comprende numerosi meccanismi molecolari utilizzati dalle cellule per ricevere e rispondere a segnali extracellullari e convertire tali informazioni in una modificazione chimica.

Il processo di risposta della cellula coinvolge specifici recettori.

Inoltre è una proprietà universale di tutte le cellule viventi definita

Trasduzione del segnale

Lezione della Prof. Franca Esposito

Molecole coinvolte nel meccanismo di trasduzione

Un segnale extracellulare è in grado di produrre un effetto nella cellula attraverso:

  1. il suo legame con un recettore
  2. l’intervento di un trasduttore (spesso rappresentato da proteine attivate dal legame con nucleotidi guanilici)
  3. un effettore (frequentemente un enzima in grado di amplificare le informazioni ricevute)

Il risultato dell’attivazione di questo meccanismo è la risposta intracellulare.

Immagine autoprodotta.

Immagine autoprodotta.


Esempi di segnali a cui una cellula risponde

I principali segnali a cui una cellula risponde con l’attivazione di specifici meccanismi di trasduzione sono:

  1. Antigeni
  2. Glicoproteine di superficie/Oligosaccaridi
  3. Segnali di differenziamento
  4. Componenti della matrice extracellulare
  5. Fattori di crescita
  6. Ormoni
  7. Luce
  8. Odori
  9. Sapori
  10. Segnali termici
  11. Neurotrasmettitori

Caratteristiche generali della Trasduzione dei segnali

Le 4 caratteristiche fondamentali dei sistemi di trasduzione dei segnali sono:

  1. specificità: solo le molecole segnale complementari al sito di legame sul recettore possono adattarsi e legarsi
  2. amplificazione: gli enzimi attivano altri enzimi, il numero di molecole in gioco aumenta geometricamente, generando cascate enzimatiche
  3. desensibilizzazione/adattamento: meccanismo di “spegnimento” o rimozione del recettore attivato mediante circuito retroattivo
  4. integrazione: 2 segnali che si legano a 2 recettori ima con effetti opposti su una caratteristca metabolica: il risultato finale è un segnale integrato di entrambi i recettori

Tipi di recettori

I recettori dei segnali extracellulari possono essere suddivisi sia in base alla loro funzione che alla loro localizzazione nella cellula.

I principali tipi di recettori sono:

  1. recettori accoppiati a proteine G
  2. recettori con attività tirosina chinasi
  3. recettori con attività guanilil ciclasica
  4. canali ionici controllati
  5. recettori di adesione
  6. recettori nucleari
La classificazione dei recettori in base alla localizzazione  in differenti compartimenti cellulari dipende dalla natura del segnale (molecole lipofile o idrofile). Immagine autoprodotta.

La classificazione dei recettori in base alla localizzazione in differenti compartimenti cellulari dipende dalla natura del segnale (molecole lipofile o idrofile). Immagine autoprodotta.


1. Recettori accoppiati a proteine G

I recettori accoppiati a proteine G posseggono 7 domini transmembrana ad α elica

Tutti presentano:

  • un “loop” tra a eliche 5 e 6 ed un segmento C-terminale nel citosol
  • un’estremità N-terminale rivolta allo spazio extracellulare

Sono presenti siti di fosforilazione citosolici che ne regolano l’attività e siti di glicosilazione extracellulare che permettono l’interazione con molecole extracellulari e altre cellule.

Tali recettori non hanno proprietà enzimatiche, si modificano in risposta al legame con il ligando, modulando l’attività di trasduttori (proteine G eterotrimeriche).

Immagine autoprodotta.

Immagine autoprodotta.


Le proteine G

Le proteine G sono così definite perché legano i nucleotidi guanilici.

Le proteine G, ancorate a lipidi di membrana, sono eterotrimeriche costituite da 3 subunità: α, β, γ.

La subunità α lega il nucleotide guanilico e può essere di natura stimolatoria (Gs) o inibitoria (Gi). Le subunità β e γ interagiscono con il recettore.

Le proteine G sono attive quando legano il GTP ed inattive quando legano il GDP.

In seguito al legame con GTP, la proteina G espone regioni prima nascoste (switch) che interagiscono con le proteine a valle.

L’idrolisi del GTP inattiva la proteina G.

Tratto da  “I principi di biochimica di Lehninger” David L. Nelson & Michael M. Cox ed Zanichelli.

Tratto da “I principi di biochimica di Lehninger” David L. Nelson & Michael M. Cox ed Zanichelli.


Regolazione dell’attività delle proteine G

Le proteine G inattive interagiscono con fattori di scambio GTP-GDP chiamati GEF (GTP/GDP exchange factors).

Spesso tali fattori sono recettori attivati come la rodopsina, i recettori β adrenergici ecc.e si attivano in seguito al legame con il GTP.

In tale forma le proteine G attivate attivano gli effettori a valle (come l’adenilato ciclasi, la cGMP fosfodiesterasi ecc.).

Altre proteine coinvolte nella regolazione dell’attività delle G protein sono le proteine GAP, al contrario queste proteine sono modulatori dell’attività GTPasica delle proteine G e determinano quanto a lungo la proteina G resterà attiva.

Anche le RGS sono regolatrici del segnale delle proteine G e ne aumentano l’attività GTPasica intrinseca.

Differenti tipi di proteine G

Modificata da Bourne HR, Sanders DA, McConnick F: Nature 348:125, 1990.

Modificata da Bourne HR, Sanders DA, McConnick F: Nature 348:125, 1990.


Esempi di Trasduzione del segnale: Adrenalina

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger”  ed. Zanichelli.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Amplificazione

Meccanismo di amplificazione

Il legame di 1 o poche molecole segnale ad uno specifico recettore multitratto transmembrana ha come conseguenza:

  1. attivazione dell’Adenilato ciclasi
  2. generazione di alcune molecole di 2° messaggero cAMP
  3. attivazione proteina chinasi A
  4. fosforilazione di differenti effettori
Immagine autoprodotta.

Immagine autoprodotta.


Esempio di trasduzione segnale adrenalina

La proteina chinasi A

La proteina chinasi A (PKA) è un dimero formato da 2 subunità regolatorie e 2 catalitiche (R2C2), cataliticamente inattivo.

Un dominio inibitorio occupa il sito di legame del cAMP sulle subunità catalitiche.

Legame cAMP (2 mol/sub) ad R2 provoca cambio conformazionale, le sequenze inibitrici fuoriescono dalle subunità catalitiche
che diventano cataliticamente attive (molteplici ma con “sequenza consensus”).

Spiazzamento di un dominio autoinibitore (es.Recettore insulina, GSK3).

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Proteine Adattatrici

 Tipi diversi di segnale possono essere mediati da un singolo secondo messaggero (cAMP) mediante confinamento in specifiche regioni cellulari da parte di proteine adattatrici.

Non hanno attività catalitica, ma mantengono unite proteine con funzioni correlate.

  • AKAP, proteine che ancorano chinasi A, come esempio di proteine adattatrici multivalenti
  • AKAP 79: Proteina chinasi A/Adenilato ciclasi
  • AKAP 250: Proteina chinasi A/Fosfodiesterasi
Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Interruzione del segnale

1. Desensibilizzazione

Quando la concentrazione di adrenalina < Kd per il recettore l’ormone si dissocia ed il recettore assume conformazione inattiva, non + in grado di attivare Gs.

2. Spegnimento

Attività GTPasica intrinseca della proteina G idrolizza GTP Gα si riassocia al dimero βγ che è incapace di stimolare l’Adenilato ciclasi.

3. Rimozione secondo messaggero

Una fosfodiesterasi dei nucleotidi ciclici idrolizza cAMP in AMP (che non è un secondo messaggero).

4. Fosdoproteine fosfatasi

Nel genoma sono noti 150 geni per le fosfatasi 500 geni per le chinasi.
Quando la concentrazione del cAMP diminuisce e PKA assume forma inattiva, la defosforilazione ad opera di Fosfatasi prevale sull’attività chinasica.

I recettori accoppiati a G protein e Patologie Umane

Modifiche di struttura ed attività dei recettori accoppiati a proteine G sono coinvolte nell’eziopatogenesi di varie patologie umane quali:

  • allergie
  • depressione
  • cecità
  • diabete
  • m. cardiovascolari

Fosfolipasi C

Una 2° classe di recettori accoppiati a proteine G comprende i recettori accoppiati alla FOSFOLIPASI C di membrana.

Essa idrolizza il fosfatidil inositolo 4,5BP (PIP2) in Inositolo 1,4,5trisP (IP3) e Diacilglicerolo (DAG).

IP3 diffonde dalla membrana al reticolo (ER) dove si lega a specifici canali del Ca++ aprendoli.

SERCA (pompa per il Ca) mantiene la concentrazione di Ca2+ nel ER di alcuni ordini di grandezza maggiore che nel citosol.

Protein chinasi C (PKC ): attivata da Ca2+ e diacilglicerolo.

Effettori: proteine neuronali, immunitarie e ciclo cellulare.

PKC costantemente attivata (tumore).

Lo spegnimento del segnale è determinato da una fosfatasi (PTEN).

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Calcio come secondo messaggero

Il Calcio è un secondo messaggero.

E’ coinvolto nei meccanismi di esocitosi neuronale, contrazione muscolare e citoscheletrici.

In cellule non stimolate il calcio è mantenuto basso.

Dopo lo stimolo il calcio aumenta per rilascio dello ione da mitocondri, ER e membrana plasmatica attraverso specifici canali.

Come conseguenza alla stimolazione c’è la risposta cellulare.

Calmodulina

La Calmodulina è un sensore per il Calcio. Possiede 4 siti di legame ad alta affinità ed un PM di 17000.

Quando il Calcio si lega alla Calmodulina essa cambia conformazione. Può modulare l’attività, affinità e conformazione di altre Ca-binding protein.

Appartiene alla famiglia Troponine ed altre EF hand proteins.

La calmodulina è una subunità della CaM chinasi (proteina chinasi calcio/calmodulina dipendente).

E’ una subunità regolatrice della glicogeno fosforilasi b chinasi muscolare.

Quindi in maniera concertata il Ca attiva la contrazione muscolare che richiede ATP (fornito dalla glicogenolisi).

La regolazione della concentrazione del calcio è molto sofisticata.

Non aumenta o diminuisce semplicemente, ma oscilla entro pochi secondi.

Ormone—>spikes—>blips—>puff—>waves

2. Recettori con attività tirosina chinasica

Sono proteine con attività enzimatica (tirosin chinasi) capaci di auto ed etero fosforilazione.

Il legame di un ormone (fattori di crescita) induce dimerizzazione e autofosforilazione dei recettori che in tal modo si attivano.

Vi sono al momento 8 sottofamiglie di recettori tirosina chinasici.

Il domino tirosina chinasi è in alcune famiglie interrotto da una regione inserita della chinasi.

Le prime 2 sottoclassi (I e II) possiedono domini extracellulari con sequenze ripetute ricche di cisteina, mentre i domini extracellulari delle altre sottoclassi hanno regioni simili alle immunoglobuline (anelli).

L’inserto chinasico è la regione intracellulare, a lunghezza variabile, principale sito di regolazione.

Il legame di una proteina induce dimerizzazione e autofosforilazione dei recettori che in tal modo si attivano.

Domini presenti in differenti recettori Tirosina chinasi. Immagine autoprodotta.

Domini presenti in differenti recettori Tirosina chinasi. Immagine autoprodotta.


Esempio di trasduzione mediata da TKR

Recettore dell’Insulina

I recettori per l’insulina sono già in forma dimerica e di conseguenza il legame dell’ormone al suo sito provoca interazione allosterica fra le due metà del recettore che induce l’autofosforilazione del recettore, che si attiva e i suoi domini catalitici fosforilano una proteina chiamata IRS-1 (substrato 1 del recettore dell’insulina).

Le protein chinasi specifiche per la tirosina svolgono un ruolo fondamentale nella trasformazione cellulare.

Le proteine G monomeriche (di tipo ras) sono coinvolte nella mediazione degli effetti che ligandi mitogeni inducono sulla proliferazione cellulare.

L’attivazione delle proteine ras si traduce nella trascrizione di alcuni geni cruciali nei processi di crescita cellulare. (es.cascata delle MAPK).

Esistono interazioni tra la via della PKC e le vie tirosin-chinasiche, l’isoforma gamma della fosfolipasi C è attivata da proteine di tipo ras.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


3. Recettori Guanil ciclasi via cGMP

Le Guanilil ciclasi sono recettori dotati di attività enzimatica e sono in grado di convertire il GTP nel secondo messaggero.

3′,5′-monofosfato ciclico (GMP ciclico, cGMP).

Molte delle azioni del cGMP sono mediate dalla proteina chinasi G (PKG).

tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


PKG

PKG, espressa solo in cellule muscolari liscie, piastrine, cellule di Purkinje del cervelletto, del cervello, dell’intestino e del rene, fosforila residui di Ser e Thr.

Sulla stessa catena polipeptidica sono presenti sia il sito catalitico che quello regolatore.

cGMP spiazza la parte del dominio regolatore, che così esce dal sito di legame attivando il dominio catalitico.

In alcune cellule il cGMP può legarsi a recettori costituiti da canali cationici con conseguente loro apertura.

3. Recettori Guanil ciclasi

Esistono 2 tipi di recettori ad attività guanilil ciclasici

a) Corpuscolato :

  • localizzato a livello della membrana plasmatica
  • dominio extracellulare è il recettore per peptide atriale natriuretico
  • (ANP/ANF) prodotto dai cardiomiociti atriali, per la guanilina e per endotossine

b) Solubile :

  • localizzata nel citosol ed attivata da Ossido nitrico/Monossido d’azoto (NO)
Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Monossido di Azoto

Vasodilatatore, importante nella regolazione della pressione sanguigna.

Implicato nell’erezione del pene; il sidenafil citrato (VIAGRA) influenza questo processo inibendo una fosfodiesterasi specifica per il cGMP.

Neurotrasmettitore nel cervello e nel sistema nervoso autonomo.

Ha un ruolo nel potenziamento a lungo termine.

Ha un ruolo nella neurotossicità.

Bassi livelli di NO sono implicati nell’eziogenesi dello spasmo del piloro nella stenosi pilorica iperclorica infantile.

Può avere un ruolo nel rilasciamento del muscolo scheletrico.

Può fare parte di un sistema immunitario primitivo.

Inibisce l’adesione, l’aggregazione e l’aggregazione delle piastrine.

Monossido di Azoto (segue)

I macrofagi quando sono stimolati producono NO per uccidere batteri e cellule tumorali.

Alti livelli di NO che si formano durante l’ictus uccidono alcuni neuroni proprio come i macrofagi uccidono i batteri.

Inibitori di NO sintasi ad animali migliorano l’ictus.

Nitroglicerina ed altri nitrovasodilatatori usati nell’Angina pectoris (contrazione da ipossia x blocco delle coronarie) basano la loro azione sul rilassamento del muscolo cardiaco da NO.

I vasodilatatori invece sono + stabili e producono un lungo e duraturo effetto miorilassante.

4. Canali ionici

La concentrazione citosolica degli ioni ed il potenziale di membrana nelle cellule sensoriali (neuroni e miociti)
è sotto il controllo di canali ionici e pompe ioniche

Differenze tra le due classi di molecole

Canali ionici:

  1. + veloci (vicini alla diffusione libera di un soluto in sol. acquosa)
  2. non saturabili
  3. controllati (aperti e chiusi in risposta a stimolo)
  4. ATP-indipendenti (in genere)
Esempio di varietà di canali ionici presenti in una giunzione neuromuscolare. 
Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Esempio di varietà di canali ionici presenti in una giunzione neuromuscolare. Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


4. Canali ionici controllati

Canali Ionici

Canali controllati d aLigandi

Proteine oligomeriche che in seguito al legame di piccole molecole intra- extracellulari subiscono una transizione molecolare allosterica che causa l’apertura o la chiusura del canale.

Canali controllati dal Voltaggio

Dominio proteico carico si sposta in risposta ad una variazione del potenziale transmembrana, causando l’apertura o la chiusura del canale.

5. Recettori di adesione

I recettori di adesione sono proteine integrali di membrana di tipo I, che possono essere classificati in diverse sottofamiglie in base ad omologie strutturali e funzionali.

Le integrine sono i recettori principali per le proteine della matrice extracellulare e del citoscheletro. Trasferiscono i segnali all’interno e all’esterno della cellula

Famiglia di recettori eterodimerici α/β (in base alle varie associazioni si formano 21 differenti integrine eterodimeriche α/β), ognuna delle quali presenta una definita specificità di legame a un determinato legante.

L’eterogeneità genetica che caratterizza i recettori di adesione cellulare è amplificata da tagli in punti diversi dell’mRNA, che portano all’espressione di isoforme funzionalmente diverse. Esse possono essere distinte in base alla sequenza del dominio di superficie, per esempio il CD44, o a quella delle porzioni citoplasmatiche, per esempio le subunità α o β dell’integrina.

Esempi di recettori di adesione. Immagine autoprodotta.

Esempi di recettori di adesione. Immagine autoprodotta.


6. Recettori nucleari

La superfamiglia dei recettori nucleari nella specie umana è composta da una cinquantina di membri.

La loro principale azione è il controllo dell’espressione dei geni bersaglio (regolazione della trascrizione).

Alcuni recettori nucleari sono fattori di trascrizione i cui ligandi sono ormoni o sostanze diffusibili attraverso le membrane cellulari.

La distribuzione tissutale e l’azione di questi molteplici recettori di uno stesso ligando possono essere diverse, offrendo quindi una grande ricchezza d’azione al ligando.

Dal punto di vista strutturale i recettori nucleari condividono un’organizzazione comune in domini: dominio di transattivazione, dominio di legame del ligando (LBD) e dominio di legame al DNA (DBD) o elemento di risposta agli ormoni.

L’attività dei recettori nucleari è regolata da coattivatori e corepressori che rivestono un ruolo importante nel controllo dell’espressione dei geni bersaglio dei recettori nucleari.

Organizzazione strutturale 
dei recettori nucleari. Immagine autoprodotta.

Organizzazione strutturale dei recettori nucleari. Immagine autoprodotta.


6. Recettori nucleari (segue)

I recettori nucleari svolgono un ruolo fondamentale e ubiquitario, intervenendo nel processo di differenziazione e di proliferazione cellulare e partecipando alla regolazione di un gran numero di funzioni (riproduzione, metabolismo osseo, ecc).

In patologia i recettori nucleari sono implicati anche in alcune anomalie dell’azione ormonale, della crescita tumorale, di alcune patologie metaboliche ecc.

Esempio di trasduzione mediata da recettori nucleari: Sistema di segnalazione Jak-Stat

L’ Eritropoietina (EPO) è una proteina di 165 aa prodotta dal rene.

In seguito al legame dell’EPO al suo recettore questo dimerizza e si lega alla Jak chinasi solubile, attivandola.

JAK fosforila la Tyr del recettore nel dominio citoplasmatico.

JAK fosforila anche fattori di trascrizione STAT inducendone la dimerizzazione e la traslocazione nucleare.

EPO è coinvolta nell’attivazione dell’espressione di geni per la maturazione dell’eritrocita.

JAK può indurre anche la via delle MAPK.

Grb2 con SH2 (src homolgy 2) lega il recettore di EPO ed attiva la cascata a valle.

Src è un’altra Tyr chinasi citoplasmatica che si lega a recettori fosforilati in Tyr.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


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