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Franca Esposito » 19.Biosintesi dei nucleotidi


Nucleotidi

  • Unità costitutive degli acidi nucleici
  • Elementi chiave del metabolismo energetico
  • Trasportatori di metaboliti attivati per reazioni di biosintesi
  • Componenti strutturali di coenzimi
  • Regolatori metabolici e molecole segnale

La lezione è della Prof. Raffaella Faraonio

Nucleotidi: biosintesi

2 vie diverse per la biosintesi dei nucleotidi:

  • Vie di sintesi de novo, a partire da precursori a basso peso molecolare
  • Vie di salvataggio (o di recupero), a partire da nucleosidi o basi azotate derivate dalla demolizione endogena di acidi nucleici (RNA e DNA)

Vie de novo: essenzialmente identiche in tutti gli organismi → la biosintesi endogena è sufficiente alle necessità cellulari.

Le riserve cellulari dei nucleotidi sono scarse (eccez. ATP) e le loro concentrazioni ≈ costanti.

Esistono malattie associate a difetti in ognuna delle due vie di biosintetiche.

Il PRPP nelle vie di biosintesi

5-fosforibosil-1-pirofosfato (PRPP): forma attivata del ribosio-5P

Partecipa ad entrambe le vie di biosintesi (de novo e di recupero) dei nucleotidi purinici e pirimidinici.

E’ sintetizzato a partire dal ribosio-5P (via dei pentosio fosfato) e ATP ad opera dell’enzima ribosio fosfato pirofosfochinasi (PRPP sintetasi):

Ribosio-5P + ATP→ PRPP + AMP

L’enzima PRPP sintetasi è regolato allostericamente da molte molecole di cui il PRPP è il precursore.

Sintesi del PRPP. Immagine autoprodotta.

Sintesi del PRPP. Immagine autoprodotta.


Le vie di biosintesi de novo

Per la costruzione dell’anello purinico sono utilizzati glutammina, glicina, aspartato, CO2 e due unità monocarboniose di formile (-CHO) trasportate dall’N10-formiltetraidrofolato.

Gli atomi dell’anello pirimidinico hanno origine dal carbamilfosfato e dall’aspartato.

Origine degli atomi dell’anello purinico. Tratto da: DL Nelson e MM Cox ”I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Origine degli atomi dell'anello purinico. Tratto da: DL Nelson e MM Cox ”I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Biosintesi de novo delle basi puriniche

La struttura dell’anello purinico viene sintetizzata sul PRPP, utilizzando amminoacidi, CO2 e unità monocarboniose. E’ richiesto ATP o GTP.

Le tappe di biosintesi -prossime diapositive- portano alla formazione dapprima dell’unità base dell’anello purinico, l’inositato (IMP), da cui si ottengono, attraverso due vie metaboliche separate, AMP e GMP.

La via di formazione dell’IMP consta di 11 tappe catalizzate da domini separati di complessi multienzimatici a localizzazione citosolica.


Sintesi de novo del nucleo purinico

1. “Tappa di comando“, un gruppo amminico della glutamina viene trasferito sul PRPP ad opera dell’enzima allosterico glutamina-PRPP amidotransferasi → 5-fosforibosilammina

2. Condensazione con la glicina, il cui gruppo carbossilico è attivato dall’ATP → glicinammide ribonucleotide (GAR)

3. Trasferimento del gruppo formile dall’ N10-formiltetraidrofolato → formilglicinammide ribonucleotide (FGAR)

4. Aggiunta di un gruppo amminico dalla glutamina in una reazione ATP-dipendente → formilglicinammidina ribonucleotide (FGAM)

5. Chiusura dell’anello imidazolico attraverso eliminazione di H2O e idrolisi di ATP → amminoimidazolo ribonucleotide (AIR)

Tappe della biosintesi dell’anello purinico dell’inositato. Tratto da: DL Nelson e MM Cox ”I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Tappe della biosintesi dell'anello purinico dell'inositato. Tratto da: DL Nelson e MM Cox ”I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Sintesi de novo del nucleo purinico (segue)

6. e 7. il 5-amminoimidazolo ribonucleotide (AIR) viene carbossilato con impiego di uno ione bicarbonato e ATP → carbossiamminoimidazolo ribonucleotide (CAIR)

8. e 9. trasferimento di un gruppo amminico dall’aspartato (in presenza di ATP) che analogamente al ciclo dell’urea fuoriesce come fumarato → 5-amminoimidazolo-4-carbossammide ribonucleotide (AICAR)

10. aggiunta di un gruppo formile dall’N10-formiltetraidrofolato → formil derivato (FAICAR)

11. chiusura dell’anello purinico con eliminazione di una molecola di H2O → inositato (IMP), precursore comune di AMP e GMP

Tappe della biosintesi dell’anello purinico dell’inositato. Tratto da: DL Nelson e MM Cox ”I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Tappe della biosintesi dell'anello purinico dell'inositato. Tratto da: DL Nelson e MM Cox ”I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Sintesi de novo dell’AMP e del GMP

La conversione dell’IMP in AMP e GMP avviene in 2 tappe e richiede aggiunta di un gruppo amminico.

1.  Sintesi dell’AMP
Utilizza acido aspartico come donatore di -NH2 e GTP come donatore di energia.

L’acido aspartico fuoriesce come fumarato

2. Sintesi del GMP
La prima reazione (NAD+-dipendente) comporta ossidazione dell’IMP a xantilato (XMP). Successivamente la glutammina dona il gruppo amminico in presenza di ATP (scisso in AMP e PPi).

Relazione reciproca: richiesta di GTP per la biosintesi di AMP e richiesta di ATP per la biosintesi di GMP.

Tappe della biosintesi dell’AMP e del GMP dall’IMP. Tratto da: DL Nelson e MM Cox ”I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Tappe della biosintesi dell'AMP e del GMP dall'IMP. Tratto da: DL Nelson e MM Cox ”I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Formazione dei nucleosidi trifosfato

2 reazioni successive di fosforilazione convertono l’AMP e il GMP nei rispettivi nucleosidi trifosfato.

La prima è operata da chinasi specifiche per l’adenilato e per il guanilato che producono rispettivamente ADP e GDP.

AMP + ATP ↔ 2 ADP (adenilato chinasi)
GMP + ATP ↔ GDP + ADP (guanilato chinasi)

L’ADP è convertito in ATP attraverso la fosforilazione ossidativa o fosforilazioni a livello del substrato.

Il GDP è convertito in GTP dalla nucleoside difosfato chinasi (NDP chinasi), enzima con elevata attività ma bassa specificità → è in grado di fosforilare tutti i NDP (purinici e pirimidinici) e i ribo- o deossiribo-nucleotidi.

GDP + ATP → GTP + ADP
CDP + ATP → CTP + ADP

Regolazione biosintesi nucleotidi purinici

Primo livello di regolazione:
formazione di 5-fosforibosilammina, tappa di comando. Enzima allosterico glutammina-PRPP amidotransferasi.
IMP, AMP e GMP: effettori negativi
PRPP: effettore positivo
AMP e GMP agiscono in modo sinergico

Secondo livello di regolazione:
GMP e AMP: inibitori della sintesi di xantilato e adenilsuccinato, rispettivamente.

Terzo livello di regolazione:
GTP e ATP: controllo reciproco sulla sintesi rispettivamente di AMP e di GMP → bilancio tra le due sintesi.

Meccanismi di regolazione a feedback della biosintesi dei nucleotidi purinici.
Immagine autoprodotta.

Meccanismi di regolazione a feedback della biosintesi dei nucleotidi purinici. Immagine autoprodotta.


Biosintesi de novo delle basi pirimidiniche

La struttura dell’anello dei nucleotidi pirimidinici viene costruita in 6 tappe utilizzando carbamilfosfato, aspartato e PRPP. E’ richiesto ATP.

La via biosintetica porta dapprima alla formazione dell’orotato che contiene l’anello pirimidinico completo.

L’orotato si condensa quindi con il PRPP e si forma orotidilato (OMP), il primo nucleotide pirimidinico. Esso viene convertito in UMP, da cui per azione di chinasi si forma UTP.

Il CTP si origina dall’UTP.

Per le reazioni vedi diapositiva successiva.


Biosintesi de novo dell’UMP

1. Sintesi del carbamilfosfato per azione dell’enzima citosolico carbamilfosfato sintetasi II (CPS II). L’NH4+ proviene dalla glutammina
2. Condensazione con l’aspartatoN-carbamilaspartato. Enzima: aspartato transcarbamilasi (ATCasi)
3. Chiusura dell’anello con eliminazione di H2O → diidroorotato. Reazione reversibile, enzima diidroorotasi
4. Deidrogenazione a orotato. Enzima mitocondriale: diidroorotato deidrogenasi (flavoproteina)
5. Condensazione dell’orotato con il PRPP → orotidilato (OMP), nucleoside pirimidinico. Enzima: orotato fosforibosiltransferasi
6. Decarbossilazione dell’ OMP → uridilato (UMP) Enzima citosolico: OMP decarbossilasi
Negli eucarioti
CPS II, ATCasi e diidroorotasi: complesso multifunzionale citosolico denominato CAD.
Orotato fosforibosiltransferasi e OMP decarbossilasi: complesso bifunzionale denominato UMP-sintasi.

Biosintesi de novo dell’UMP. Modificato da: DL Nelson e MM Cox ”I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Biosintesi de novo dell'UMP. Modificato da: DL Nelson e MM Cox ”I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Biosintesi de novo delle basi pirimidiniche

Sintesi del CTP ↔ 3 reazioni successive a partire dall’UMP, catalizzate dagli enzimi:

  1. uridilato chinasi → fosforilazione dell’UMP con formazione di UDP
  2. nucleoside difosfato chinasi → conversione dell’UDP in UTP
  3. CTP sintetasi → formazione del CTP dall’UTP

CTP sintetasi: Enzima allosterico che catalizza il trasferimento del gruppo amminico dalla glutammina al C-4 dell’UTP. La reazione richiede ATP.

Regolazione biosintesi nucleotidi pirimidinici

Regolazioni diverse in procarioti ed eucarioti.

Nei batteri: un solo sito di regolazione, tappa di formazione del carbamilaspartato ad opera dell’enzima aspartato transcarbamilasi (ATCasi).

Regolazione allosterica

CTP → inibitore

ATP attivatore

Regolazione dell’aspartato transcarbamilasi batterica. Tratto da: DL Nelson e MM Cox ”I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Regolazione dell'aspartato transcarbamilasi batterica. Tratto da: DL Nelson e MM Cox ”I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Regolazione biosintesi nucleotidi pirimidinici (segue)

3 siti di regolazione negli eucarioti

  1. Sintesi del carbamilfosfato: l’enzima CPS II è inibito da UDP e UTP ed attivato da ATP e PRPP
  2. Sintesi dell’UMP dall’OMP: l’enzima OMP decarbossilasi è inibito dall’UMP
  3. Sintesi del CTP dall’UTP: l’enzima CTP sintetasi è regolato con cinetica sigmoide omotropica dall’UTP (attivatore) e dal CTP (inibitore)
Regolazione negli eucarioti. Immagine autoprodotta.

Regolazione negli eucarioti. Immagine autoprodotta.


Biosintesi dei deossiribonucleotidi

I deossiribonucleotidi servono solo come precursori del DNA concentrazioni intracellulari basse (5-10 volte < dei ribonucleotidi).

Si formano dai rispettivi ribonucleotidi difosfato (rNDP).

Un solo enzima responsabile della riduzione dei ribonucleotidi ai loro derivati: ribonucleotide reduttasi (rNDP reduttasi).

La riduzione avviene a livello di un atomo di carbonio non attivato e comporta la sostituzione del gruppo ossidrile sul C-2 del ribosio con lo ione idruro.

Il donatore di elettroni è il NADPH che li trasferisce mediante la tioredossina (Trx) o la glutaredossina (Grx).

Esistono regolazioni strette tra sintesi del DNA e biosintesi dei deossiribonucleotidi.

Formazione deossiribonucleotidi: rNDP reduttasi

NDP → dNDP + H2O

rNDP reduttasi:

  • enzima tetramerico con 2 subunità R1 e 2 R2
  • 2 siti attivi localizzati alle interfacce delle subunità
  • meccanismo di reazione con formazione di un radicale proteico

In ciascun sito attivo:

  • 2 gruppi -SH, derivati da cisteine della subunità R1, essenziali per la catalisi
  • un gruppo -XH, derivato dalla subunità R2 che partecipa come sito radicalico proteico

Formazione deossiribonucleotidi: rNDP reduttasi (segue)

3 classi di rNDP reduttasi: differenze nella struttura, tipo di cofattore/metallo e origine del radicale proteico.

In E. Coli e nella maggior parte di organismi: classe I ↔ cofattore formato da 2 atomi di Fe3+ contenenti ossigeno (Fe-O-Fe) e radicale proteico formato da tirosina.

Nella reazione vengono ossidati i 2 gruppi –SH del sito attivo, successivamente ridotti per azione di Trx o Grx.

Meccanismo rNDP reduttasi

Meccanismo di reazione  della ribonucleotide reduttasi. Tratto da: DL Nelson e MM Cox ”I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Meccanismo di reazione della ribonucleotide reduttasi. Tratto da: DL Nelson e MM Cox ”I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Riduzione dei ribonucleotidi

Fonte degli elettroni per la riduzione dei NDP: NADPH.

Essi vengono donati alla ribonucleotide reduttasi attraverso coenzimi insoliti proteici: la tioredossina oppure la glutaredossina.

La rigenerazione della tioredossina avviene ad opera della tioredossina reduttasi, un enzima flavinico che contiene selenio.

La glutaredossina viene ridotta dalla glutaredossina reduttasi che richiede il glutatione.

Riduzione dei ribonucleotidi. Tratto da: DL Nelson e MM Cox ”I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Riduzione dei ribonucleotidi. Tratto da: DL Nelson e MM Cox ”I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Riduzione dei ribonucleotidi: tioredossina

Proteina ubiquitaria con funzione di coenzima

PM: 12.000 (105 aa)

Coinvolta in vari processi biologici

Contiene 2 residui di cisteina distanziati da due amminoacidi: -Cys-Gly-Pro-Cys-

I gruppi tiolici attraverso ossidazione e riduzione reversibile consentono la riduzione dei gruppi -SH nel sito attivo dell’enzima ribonucleotide reduttasi.

La forma ossidata della tioredossina viene ridotta tramite l’intervento della tioredossina reduttasi, che trasferisce equivalenti riducenti provenienti dal NADPH.

Tioredossina. Immagine da Wikipedia .

Tioredossina. Immagine da Wikipedia .


Regolazione della ribonucleotide reduttasi

Enzima con regolazione allosterica peculiare: di attività e specificità del substrato.

  • Siti di attività controllati da ATP (attivatore) e dATP (inibitore)
  • Siti di specificità regolati da ATP, dATP, dTTP, dGTP che modulando l’attività dell’enzima verso i differenti substrati in modo da equilibrare la velocità di produzione dei 4 dNTP
Regolazione della ribonucleotide reduttasi. Tratto da: DL Nelson e MM Cox ”I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Regolazione della ribonucleotide reduttasi. Tratto da: DL Nelson e MM Cox ”I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Biosintesi del timidilato

Il timidilato (dTMP) che viene successivamente fosforilato a dTTP, è sintetizzato maggiormente dai deossiribonucleotidi.

Il precursore più immediato del dTMP è il dUMP che viene metilato per azione dell’enzima timidilato sintasi (reazioni nella prossima diapositiva).

Il dUTP, precursore del dUMP, viene formato sia per fosforilazione del dUDP che per deamminazione del dCTP.


Sintesi del dTMP

La conversione dUMP → dTMP è catalizzata dall’enzima timidilato sintasi. Il donatore di unità monocarboniose è l’
N5,N10-metilene tetraidrofolato.

Questo dona il gruppo metilenico (-CH2-) e due elettroni (sotto forma di ione idruro) necessari per ridurlo a gruppo metile.

L’ N5,N10-metilene tetraidrofolato si ossida a diidrofolato che viene rigenerato successivamente ad opera della diidrofolato reduttasi e della serina idrossimetil-transferasi.

Conversione del dUMP a dTMP. Tratto da: DL Nelson e MM Cox ”I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Conversione del dUMP a dTMP. Tratto da: DL Nelson e MM Cox ”I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Sintesi di timidilato e folato: bersaglio di agenti chemioterapici

Timidilato sintasi: inibito dal FdUMP, prodotto di conversione del fluorouracile.

Diidrofolato reduttasi: inibito competitivamente dal metotrexato, analogo del folato.

Fluorouracile e metotrexato: agenti chemioterapici che interferiscono con la sintesi della timina. Tratto da: DL Nelson e MM Cox ”I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli

Fluorouracile e metotrexato: agenti chemioterapici che interferiscono con la sintesi della timina. Tratto da: DL Nelson e MM Cox ”I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli


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