La lezione è della Prof. Raffaella Faraonio
2 vie diverse per la biosintesi dei nucleotidi:
Vie de novo: essenzialmente identiche in tutti gli organismi → la biosintesi endogena è sufficiente alle necessità cellulari.
Le riserve cellulari dei nucleotidi sono scarse (eccez. ATP) e le loro concentrazioni ≈ costanti.
Esistono malattie associate a difetti in ognuna delle due vie di biosintetiche.
5-fosforibosil-1-pirofosfato (PRPP): forma attivata del ribosio-5P
Partecipa ad entrambe le vie di biosintesi (de novo e di recupero) dei nucleotidi purinici e pirimidinici.
E’ sintetizzato a partire dal ribosio-5P (via dei pentosio fosfato) e ATP ad opera dell’enzima ribosio fosfato pirofosfochinasi (PRPP sintetasi):
Ribosio-5P + ATP→ PRPP + AMP
L’enzima PRPP sintetasi è regolato allostericamente da molte molecole di cui il PRPP è il precursore.
Per la costruzione dell’anello purinico sono utilizzati glutammina, glicina, aspartato, CO2 e due unità monocarboniose di formile (-CHO) trasportate dall’N10-formiltetraidrofolato.
Gli atomi dell’anello pirimidinico hanno origine dal carbamilfosfato e dall’aspartato.
La struttura dell’anello purinico viene sintetizzata sul PRPP, utilizzando amminoacidi, CO2 e unità monocarboniose. E’ richiesto ATP o GTP.
Le tappe di biosintesi -prossime diapositive- portano alla formazione dapprima dell’unità base dell’anello purinico, l’inositato (IMP), da cui si ottengono, attraverso due vie metaboliche separate, AMP e GMP.
La via di formazione dell’IMP consta di 11 tappe catalizzate da domini separati di complessi multienzimatici a localizzazione citosolica.
1. “Tappa di comando“, un gruppo amminico della glutamina viene trasferito sul PRPP ad opera dell’enzima allosterico glutamina-PRPP amidotransferasi → 5-fosforibosilammina
2. Condensazione con la glicina, il cui gruppo carbossilico è attivato dall’ATP → glicinammide ribonucleotide (GAR)
3. Trasferimento del gruppo formile dall’ N10-formiltetraidrofolato → formilglicinammide ribonucleotide (FGAR)
4. Aggiunta di un gruppo amminico dalla glutamina in una reazione ATP-dipendente → formilglicinammidina ribonucleotide (FGAM)
5. Chiusura dell’anello imidazolico attraverso eliminazione di H2O e idrolisi di ATP → amminoimidazolo ribonucleotide (AIR)
6. e 7. il 5-amminoimidazolo ribonucleotide (AIR) viene carbossilato con impiego di uno ione bicarbonato e ATP → carbossiamminoimidazolo ribonucleotide (CAIR)
8. e 9. trasferimento di un gruppo amminico dall’aspartato (in presenza di ATP) che analogamente al ciclo dell’urea fuoriesce come fumarato → 5-amminoimidazolo-4-carbossammide ribonucleotide (AICAR)
10. aggiunta di un gruppo formile dall’N10-formiltetraidrofolato → formil derivato (FAICAR)
11. chiusura dell’anello purinico con eliminazione di una molecola di H2O → inositato (IMP), precursore comune di AMP e GMP
La conversione dell’IMP in AMP e GMP avviene in 2 tappe e richiede aggiunta di un gruppo amminico.
1. Sintesi dell’AMP
Utilizza acido aspartico come donatore di -NH2 e GTP come donatore di energia.
L’acido aspartico fuoriesce come fumarato
2. Sintesi del GMP
La prima reazione (NAD+-dipendente) comporta ossidazione dell’IMP a xantilato (XMP). Successivamente la glutammina dona il gruppo amminico in presenza di ATP (scisso in AMP e PPi).
Relazione reciproca: richiesta di GTP per la biosintesi di AMP e richiesta di ATP per la biosintesi di GMP.
2 reazioni successive di fosforilazione convertono l’AMP e il GMP nei rispettivi nucleosidi trifosfato.
La prima è operata da chinasi specifiche per l’adenilato e per il guanilato che producono rispettivamente ADP e GDP.
AMP + ATP ↔ 2 ADP (adenilato chinasi)
GMP + ATP ↔ GDP + ADP (guanilato chinasi)
L’ADP è convertito in ATP attraverso la fosforilazione ossidativa o fosforilazioni a livello del substrato.
Il GDP è convertito in GTP dalla nucleoside difosfato chinasi (NDP chinasi), enzima con elevata attività ma bassa specificità → è in grado di fosforilare tutti i NDP (purinici e pirimidinici) e i ribo- o deossiribo-nucleotidi.
GDP + ATP → GTP + ADP
CDP + ATP → CTP + ADP
Primo livello di regolazione:
formazione di 5-fosforibosilammina, tappa di comando. Enzima allosterico glutammina-PRPP amidotransferasi.
IMP, AMP e GMP: effettori negativi
PRPP: effettore positivo
AMP e GMP agiscono in modo sinergico
Secondo livello di regolazione:
GMP e AMP: inibitori della sintesi di xantilato e adenilsuccinato, rispettivamente.
Terzo livello di regolazione:
GTP e ATP: controllo reciproco sulla sintesi rispettivamente di AMP e di GMP → bilancio tra le due sintesi.
La struttura dell’anello dei nucleotidi pirimidinici viene costruita in 6 tappe utilizzando carbamilfosfato, aspartato e PRPP. E’ richiesto ATP.
La via biosintetica porta dapprima alla formazione dell’orotato che contiene l’anello pirimidinico completo.
L’orotato si condensa quindi con il PRPP e si forma orotidilato (OMP), il primo nucleotide pirimidinico. Esso viene convertito in UMP, da cui per azione di chinasi si forma UTP.
Il CTP si origina dall’UTP.
Per le reazioni vedi diapositiva successiva.
1. Sintesi del carbamilfosfato per azione dell’enzima citosolico carbamilfosfato sintetasi II (CPS II). L’NH4+ proviene dalla glutammina
2. Condensazione con l’aspartato → N-carbamilaspartato. Enzima: aspartato transcarbamilasi (ATCasi)
3. Chiusura dell’anello con eliminazione di H2O → diidroorotato. Reazione reversibile, enzima diidroorotasi
4. Deidrogenazione a orotato. Enzima mitocondriale: diidroorotato deidrogenasi (flavoproteina)
5. Condensazione dell’orotato con il PRPP → orotidilato (OMP), nucleoside pirimidinico. Enzima: orotato fosforibosiltransferasi
6. Decarbossilazione dell’ OMP → uridilato (UMP) Enzima citosolico: OMP decarbossilasi
Negli eucarioti
CPS II, ATCasi e diidroorotasi: complesso multifunzionale citosolico denominato CAD.
Orotato fosforibosiltransferasi e OMP decarbossilasi: complesso bifunzionale denominato UMP-sintasi.
Sintesi del CTP ↔ 3 reazioni successive a partire dall’UMP, catalizzate dagli enzimi:
CTP sintetasi: Enzima allosterico che catalizza il trasferimento del gruppo amminico dalla glutammina al C-4 dell’UTP. La reazione richiede ATP.
Regolazioni diverse in procarioti ed eucarioti.
Nei batteri: un solo sito di regolazione, tappa di formazione del carbamilaspartato ad opera dell’enzima aspartato transcarbamilasi (ATCasi).
Regolazione allosterica
CTP → inibitore
ATP → attivatore
3 siti di regolazione negli eucarioti
I deossiribonucleotidi servono solo come precursori del DNA → concentrazioni intracellulari basse (5-10 volte < dei ribonucleotidi).
Si formano dai rispettivi ribonucleotidi difosfato (rNDP).
Un solo enzima responsabile della riduzione dei ribonucleotidi ai loro derivati: ribonucleotide reduttasi (rNDP reduttasi).
La riduzione avviene a livello di un atomo di carbonio non attivato e comporta la sostituzione del gruppo ossidrile sul C-2 del ribosio con lo ione idruro.
Il donatore di elettroni è il NADPH che li trasferisce mediante la tioredossina (Trx) o la glutaredossina (Grx).
Esistono regolazioni strette tra sintesi del DNA e biosintesi dei deossiribonucleotidi.
NDP → dNDP + H2O
rNDP reduttasi:
In ciascun sito attivo:
3 classi di rNDP reduttasi: differenze nella struttura, tipo di cofattore/metallo e origine del radicale proteico.
In E. Coli e nella maggior parte di organismi: classe I ↔ cofattore formato da 2 atomi di Fe3+ contenenti ossigeno (Fe-O-Fe) e radicale proteico formato da tirosina.
Nella reazione vengono ossidati i 2 gruppi –SH del sito attivo, successivamente ridotti per azione di Trx o Grx.
Meccanismo di reazione della ribonucleotide reduttasi. Tratto da: DL Nelson e MM Cox ”I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.
Fonte degli elettroni per la riduzione dei NDP: NADPH.
Essi vengono donati alla ribonucleotide reduttasi attraverso coenzimi insoliti proteici: la tioredossina oppure la glutaredossina.
La rigenerazione della tioredossina avviene ad opera della tioredossina reduttasi, un enzima flavinico che contiene selenio.
La glutaredossina viene ridotta dalla glutaredossina reduttasi che richiede il glutatione.
Proteina ubiquitaria con funzione di coenzima
PM: 12.000 (105 aa)
Coinvolta in vari processi biologici
Contiene 2 residui di cisteina distanziati da due amminoacidi: -Cys-Gly-Pro-Cys-
I gruppi tiolici attraverso ossidazione e riduzione reversibile consentono la riduzione dei gruppi -SH nel sito attivo dell’enzima ribonucleotide reduttasi.
La forma ossidata della tioredossina viene ridotta tramite l’intervento della tioredossina reduttasi, che trasferisce equivalenti riducenti provenienti dal NADPH.
Tioredossina. Immagine da Wikipedia .
Enzima con regolazione allosterica peculiare: di attività e specificità del substrato.
Il timidilato (dTMP) che viene successivamente fosforilato a dTTP, è sintetizzato maggiormente dai deossiribonucleotidi.
Il precursore più immediato del dTMP è il dUMP che viene metilato per azione dell’enzima timidilato sintasi (reazioni nella prossima diapositiva).
Il dUTP, precursore del dUMP, viene formato sia per fosforilazione del dUDP che per deamminazione del dCTP.
La conversione dUMP → dTMP è catalizzata dall’enzima timidilato sintasi. Il donatore di unità monocarboniose è l’
N5,N10-metilene tetraidrofolato.
Questo dona il gruppo metilenico (-CH2-) e due elettroni (sotto forma di ione idruro) necessari per ridurlo a gruppo metile.
L’ N5,N10-metilene tetraidrofolato si ossida a diidrofolato che viene rigenerato successivamente ad opera della diidrofolato reduttasi e della serina idrossimetil-transferasi.
Timidilato sintasi: inibito dal FdUMP, prodotto di conversione del fluorouracile.
Diidrofolato reduttasi: inibito competitivamente dal metotrexato, analogo del folato.
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