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Franca Esposito » 5.Gli enzimi: cinetica enzimatica, attivatori ed inibitori, coenzimi


Cinetica enzimatica

Velocità reazione enzimatica

La velocità di reazione può essere espressa come indicato nella figura a lato.

  • Si usa la derivata perché è necessario definire intervalli di tempo infinitesimali (le variazioni di concentrazione nell’unità di tempo diventano sempre più modeste col procedere della reazione)
  • La velocità è la tangente alla curva [S] o [P] versus tempo
  • Nelle cinetiche enzimatiche consideriamo: velocità iniziale (vi o v0) velocità della reazione inversa = 0 e assenza di eventuale inibizione da prodotto

Lezione della Prof. Margherita Ruoppolo


Cinetica enzimatica (segue)

Questo grafico riporta la formazione del prodotto in funzione del tempo a concentrazione di E costante.

Sono rappresentate concentrazioni di substrato [S] variabili.

Per qualsiasi [S] nelle fasi iniziali la curva ha un andamento lineare ed è per questo che si definisce la Vo ovvero la velocità iniziale.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Cinetica enzimatica (segue)

Teoria di Michaelis & Menten

Equazione di velocità della reazione enzimatica in funzione della concentrazione del substrato (spiegazione teorica per l’andamento iperbolico della curva).

Per una trattazione completa della teoria di Michaelis e Menten vedere il file di approfondimento.


Cinetica enzimatica (segue)

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Cinetica enzimatica (segue)

Immagine autoprodotta.

Immagine autoprodotta.


Equazione di Lineweaver-Burk

Immagine autoprodotta.

Immagine autoprodotta.


Cinetica enzimatica

Il valore di Km:

  • Varia considerevolmente da un enzima all’altro
  • Varia per substrati diversi dello stesso enzima
  • Varia in funzione della temperatura e del pH

Cinetica enzimatica (segue)

Confronto Km di E che catalizzano la stessa reazione

Esoso + ATP → Esoso-P + ADP

ESOCHINASI : Km = ~ 0.1 mM glucosio; 1.5 mM fruttosio
GLUCOCHINASI (isoenzima epatico): Km = 10 mM glucosio
Il confronto fra questi numeri ci dà informazioni sul metabolismo degli zuccheri:

  • glucosio nel sangue condizioni normali = 5 mM ——> esochinasi è attiva nelle cellule e glucochinasi epatica non compete per il glucosio
  • glucosio nel sangue dopo pranzo > 10 mM ——> glucochinasi epatica attiva sul glucosio

Inoltre il confronto fra I due valori di Km ci dice che il glucosio è preferito al fruttosio.

Cinetica enzimatica (segue)

Velocità reazione enzimatica

Fattori che influenzano la velocità di una reazione enzimatica:

  • temperatura
  • pH
  • concentrazione dell’enzima
  • concentrazione del substrato
  • inibitori o attivatori
  • modifiche covalenti

Cinetica enzimatica (segue)

Effetto del pH

Il pH può far variare sia la Km che la kcat di un enzima attraverso la protonazione/deprotonazione di determinati residui aa (acidi o basici) che partecipano al meccanismo di catalisi.

L’effetto del pH si manifesta in genere con una curva a campana Ogni enzima comunque ha il suo caratteristico valore di pH a cui manifesta la sua massima attività

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Cinetica enzimatica (segue)

Reazioni enzimatiche più complesse

Non sempre le reazioni enzimatiche sono semplici e di conseguenza l’equazione di Michaelis & Menten non è sempre valida (in alcuni casi può essere corretta).

Reazioni a spostamento singolo (sequenziali), in cui due substrati si legano insieme all’enzima per poter generare il/i prodotto/i (meccanismo ordinato o casuale).

Reazioni a spostamento doppio (ping-pong), in cui il secondo substrato può legarsi all’enzima solo dopo che il primo substrato è stato convertito in prodotto.

Cinetica enzimatica (segue)

Isoenzimi

Gli isoenzimi (isozimi) sono forme multiple dello stesso enzima (catalizzano quindi la stessa reazione), in genere sono differentemente distribuiti nei vari tessuti.

Hanno sequenze aa simili, ma non identiche ed i rispettivi geni codificanti hanno in genere un’origine evolutiva comune.

Il meccanismo di catalisi degli isoenzimi è lo stesso, ma variano i loro parametri cinetici (Km e Vmax), così come la loro eventuale regolazione.

La caratterizzazione delle varie forme isoenzimatiche di un enzima si è spesso rivelato un importante strumento diagnostico, come ad esempio per le diverse forme isoenzimatiche della lattato deidrogenasi (LDH) o creatina chinasi (CK) presenti nel sangue.

Attivatori ed inibitori

Sostanze che aumentano l’attività enzimatica sono detti attivatori.

Sostanze che diminuiscono l’attività enzimatica o rendono l’enzima inattivo sono detti inibitori.

Attivatori ed inibitori (segue)

Inibizione enzimatica

Gli inibitori sono sostanze (in genere piccole molecole), che legandosi all’E, ne riducono l’attività, modificando l’affinità per il substrato e/o la velocità di catalisi.

Lo studio degli inibitori è di fondamentale importanza per:

  • individuare gli stadi sequenziali di una via metabolica
  • scoprire che un substrato può seguire vie metaboliche parallele
  • sviluppo di agenti terapeutici (es. aspirina inibitore dell’enzima COX)

Gli inibitori si distinguono in:

  • reversibili: modificano le proprietà dell’enzima attraverso una interazione non covalente con esso
  • irreversibili: modificano le proprietà dell’enzima legandosi covalentemente ad esso (inattivatori o inibitori suicidi)

Attivatori ed inibitori (segue)

Inibizione reversibile

Si può classificare definendo :

  • con quale sito di E interagisce l’inibitore I (sito attivo o altro sito di E)
  • a quale forma di E (libera o complessata con S) si lega I

I diversi tipi di inibizione reversibile sono anche distinti anche sulla base dei diversi effetti sui parametri cinetici dell’enzima (Km, Vmax e kcat).

I diversi tipi di inibizione reversibile:

  • inibizione competitiva
  • inibizione incompetitiva
  • inibizione mista

Attivatori ed inibitori (segue)

Inibizione competitiva

  • Inibitore compete con il substrato per il legame al sito attivo dell’enzima e la reazione non può avvenire
  • Deve aumentare la [S] per raggiungere Vmax
Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

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Attivatori ed inibitori (segue)

Inibizione incompetitiva

  • Inibitore si lega ad un sito diverso dal substrato e solo al complesso ES
  • Enzima è inattivo anche se il substrato è presente
  • Deve aumentare [E]
Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Attivatori ed inibitori (segue)

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

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Enzimi regolatori

Enzimi Allosterici

Sono costituiti :

  • da più subunità
  • in presenza di modulatori possono assumere diverse conformazioni a più alta o più bassa affinità per S

Modulatori

Le molecole che aumentano l’affinità e la velocità catalitica vengono detti effettori positivi.

Le molecole che diminuiscono l’affinità e la velocità catalitica vengono detti inibitori.

Enzimi regolatori (segue)

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

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Coenzimi

Vitamine

Le vitamine sono composti organici che l’organismo non produce e devono essere introdotti con la dieta Si dividono in due grandi categorie: idrosolubili e liposolubili. Le vitamine liposolubili verranno trattate nella lezione n.15.

La maggior parte delle vitamine idrosolubili svolge importanti funzioni coenzimatiche.

Le vitamine idrosolubili possono essere eliminate con le urine se presenti in eccesso.

Il complesso delle vitamine B esplica la propria azione fisiologica solo dopo essere state trasformate nell’organismo nei corrispondenti coenzimi.

Coenzimi (segue)

I coenzimi derivati dalle vitamine del complesso B

Le più importanti vitamine idrosolubili sono:

  • tiamina (B1), precursore del TiaminaPirofosfato (carbossilasi)
  • riboflavina (B2), precursore dei coenzimi flavinici FAD e FMN
  • niacina (B3), precursore di NAD e NADP
  • acido pantotenico (B5), costituente del Coenzima A
  • piridossina (B6), precursore del PLP
  • biotina (H)
  • acido folico (M), acido tetraidrofolico e acidi folinici
  • cianocobalamina (B12), coenzimi cobamidici: deossiadenosilcobamide
  • acido ascorbico (C)

Coenzimi (segue)

Trasportatori di elettroni

I più comuni trasportatori di elettroni sono quattro coenzimi nucleotidici:

FAD, FMN, NAD+, NADP+

Il flusso di elettroni implica la presenza di trasportatori di elettroni specializzati, che accettano temporaneamente gli elettroni ceduti dai metaboliti per donarli in tappe successive

Coenzimi (segue)

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

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Coenzimi (segue)

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

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Coenzimi (segue)

TPP = la parte attiva è l’anello tiazolico

L’H legato al C2 dell’anello tiazolico è acido e quindi si dissocia come H+, generando il carbanione della TPP.

Nella reazione catalizzata dalla piruvato decarbossilasi, il carbanione della TPP lega il gruppo carbonilico del piruvato.

Acido piruvico → Acetaldeide + CO2

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

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Coenzimi (segue)

Coenzima A

Il Coenzima A è costituito da:

  • 1 molecola di ADP legata all’acido pantotenico
  • a sua volta l’acido pantotenico è legato con il gruppo carbossile ad un residuo di β-mercapto etilamina
Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

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Coenzimi (segue)

PLP: gruppo prostetico delle amminotransferasi.

Si lega mediante il suo gruppo aldeidico al gruppo NH2 di una lisina dell’enzima, formando una base di Schiff
Coenzimi

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

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Coenzimi (segue)

Biotina: gruppo prostetico di carbossilasi Si lega al gruppo ε-NH2 di una lisina dell’enzima con il suo gruppo carbossilico (legame amidico).

Lega lo ione HCO3 su uno dei suoi due atomi di azoto (nucleofilo) dell’anello.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

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I materiali di supporto della lezione

Teoria di Michaelis e Menten.

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