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Fosforilazione ossidativa

La fosforilazione ossidativa è il processo centrale del metabolismo energetico di tutti gli organismi aerobi con cui si sintetizza gran parte dell’ATP necessario ai processi vitali.

Negli eucarioti la fosforilazione ossidativa avviene nei mitocondri.

La degradazione dei carboidrati, acidi grassi ed amminoacidi produce coenzimi ridotti (NADH e FADH₂), ricchi di energia.

NADH e FADH₂ a livello della membrana mitocondriale interna, cedono gli elettroni ad una catena di trasporto di elettroni che ha come accettore finale l’ossigeno atmosferico che viene ridotto ad H₂O (respirazione cellulare).

Durante tale processo parte dell’energia contenuta nei coenzimi ridotti è utilizzata per la sintesi di ATP a partire da ADP e P_i.

La lezione è della Prof. Margherita Ruoppolo

Contenuto ed attività del mitocondrio

All’interno della matrice mitocondriale si verificano processi catabolici, infatti nella matrice sono localizzati:

• complesso della piruvato deidrogenasi
• enzimi del ciclo di Krebs
• enzimi della β-ossidazione degli acidi grassi
• enzimi della degradazione degli amminoacidi

La catena di trasporto degli elettroni (catena respiratoria) è in gran parte costituita da proteine integrali (complessi I-IV, ATP sintasi F_oF₁) ancorate alla membrana mitocondriale interna tranne il citocromo c, idrosolubile, localizzato nello spazio intermembrana.

Trasporto attraverso membrana mitocondriale

Il passaggio dei metaboliti attraverso la membrana mitocondriale interna avviene grazie alla presenza nella membrana di trasportatori specifici.

Necessitano di trasportatori specifici:

• piruvato (prodotto finale della glicolisi)
• acidi grassi
• amminoacidi e alcuni loro derivati α-chetoacidi
• ADP e P_i (in ingresso)
• ATP ( in uscita)

Il NADH e il NADPH, nonché i coenzimi flavinici legati alle flavoproteine, non possono attraversare la membrana mitocondriale interna e cedono i propri equivalenti riducenti ad altri trasportatori localizzati nella membrana.

Catena respiratoria: Complesso I

Il Complesso I, costituito da più di 43 catene peptidiche, un FMN ed almeno 6 centri Fe–S; catalizza una serie di reazioni in cui gli elettroni del NADH sono trasferiti all’ubichinone (Q).

Per tale motivo il Complesso I viene anche chiamato NADH:ubichinone ossidoreduttasi o NADH deidrogenasi.

I due elettroni trasportati dal NADH passano prima all’ FMN e, dopo una serie di passaggi mediati da centri Fe–S, arrivano all’ultima proteina Fe–S del braccio corto, chiamata N–2.

Gli elettroni passano poi nel braccio lungo a Q che, diventato QH₂, diffonde liberamente nella membrana mitocondriale.

Complesso II

Il Complesso II, costituito da 4 subunità peptidiche (A → D) e 5 gruppi prostetici, ha una porzione transmembranica (subunità C e D) ed una estensione rivolta verso la matrice (subunità A e B).

La subunità A è la succinato deidrogenasi (enzima del ciclo di Krebs), che accoglie il substrato succinato ed a cui è legato covalentemente il FAD, mentre la subunità B contiene tre centri 2Fe–2S.

La parte transmembranica è costituita dalle proteine integrali di membrana C e D, a cui sono legati un eme di tipo b e l’ubichinone, accettore finale di elettroni.

L’eme b non interviene nel trasporto degli elettroni, ma ha un ruolo protettivo: previene la fuoriuscita accidentale di elettroni, che in presenza di O₂ possono portare alla formazione di ROS (specie reattive dell’ossigeno: O₂–•, H₂O₂).

Il Complesso II viene chiamato anche succinato: ubichinone ossidoreduttasi o succinato deidrogenasi.

Complesso I

La serie di reazioni del Complesso I può essere schematizzata in due processi accoppiati e simultanei.

1. Trasferimento esoergonico all’ubichinone (Q) di un H^– dal NADH e di un H⁺ dal solvente della matrice (2 ioni H⁺ e 2 e^–):

NADH + H⁺ + Q → NAD⁺ + QH₂

2. Espulsione endoergonica di 4 ioni H⁺ dalla matrice verso lo spazio intermembrana:

4 H⁺_matrice → 4 H⁺_intermembr.

L’intero processo è esoergonico (vettoriale: matrice → intermembr.) ed il Complesso I funziona quindi come una pompa di protoni:

NADH + 5 H⁺_matrice + Q → NAD⁺ + QH₂ + 4 H⁺_intermembr.

In seguito alla perdita dei protoni la matrice acquisisce una carica negativa, mentre lo spazio intermembrana si carica positivamente (per ogni coppia di elettroni trasportata dal NADH la matrice espelle 4 H⁺).

Questo flusso di protoni crea un potenziale elettrochimico tra i due lati della membrana mitocondriale che sarà poi utilizzato per la sintesi di ATP.

Complesso III

Contiene 11 subunità diverse, di cui quattro con ruolo funzionale: il citocromo b₅₆₂, il citocromo b₅₆₆, il citocromo c₁ e una proteina Fe–S di Rieske (la forma attiva è dimerica: 22 proteine).

Il Complesso III accetta gli elettroni trasportati da QH₂ e li trasferisce al trasportatore idrosolubile citocromo c.

Il Complesso III viene anche chiamato ubichinone: citocromo c ossidoreduttasi oppure complesso del citocromo bc₁.

Come per il Complesso I, nel Complesso III il trasferimento di elettroni da QH₂ al citocromo c è accoppiato al trasporto vettoriale di ioni H⁺ dalla matrice verso lo spazio intermembrana.

La reazione complessiva catalizzata dal Complesso III è quindi:

QH₂ + 2 Cit. c(Fe³⁺) + 2 H⁺_matrice → Q + 2 Cit. c(Fe²⁺) + 4 H⁺_intermembr.

Anche in questo caso quindi il flusso protonico crea ai lati della membrana il potenziale elettrochimico per la sintesi dell’ATP.

Complesso IV

Anche il Complesso IV è legato alla membrana mitocondriale, con una porzione che protrude nello spazio intermembrana.

E’ costituito da 13 subunità, di cui 3 cruciali per la funzione:

• subunità I (centrale) con due gruppi eme a e a3 ed uno ione Cu (Cu_B)
• subunità II (destra) con altri due ioni Cu (centro binucleare Cu_A)
• subunità III (sinistra) con ruolo oscuro

Il complesso IV, chiamato anche citocromo ossidasi, è l’ultimo componente della catena respiratoria e trasferisce gli elettroni dal citocromo c all’O₂ riducendolo ad H₂O.

Inoltre, accoppiata a questa reazione di ossido-riduzione c’è l’espulsione di altri 4 ioni H⁺ dalla matrice.

Complesso IV (segue)

Attenzione alla stechiometria del Complesso IV

Per ogni coppia di e^– (2 cit. c) si ha espulsione di 2 H⁺ dalla matrice.

Per la riduzione dell’O₂ a 2 molecole di H₂O sono necessari 4 e^– (4 cit. c) oltre ai 4 ioni H⁺ della matrice.

Quindi, se si tiene conto della stechiometria del Complesso III (da cui si ottengono 2 cit. c ridotti) la reazione complessiva del Complesso IV è:

2 Cit. c_red + 4 H⁺_matrice + 1/2 O₂ → 2 Cit. c_ox + H₂O + 2 H⁺_intermembr.

Se invece si considera la riduzione di 1 molecola di O₂:

4 Cit. c_red + 8 H⁺_matrice + O₂ → 4 Cit. c_ox + 2 H₂O + 4 H⁺_intermembr.

Anche dalla reazione catalizzata dal Complesso IV si crea un flusso di protoni (potenziale elettrochimico) utilizzabile per la sintesi di ATP.

Termodinamica della catena di trasporto degli elettroni (non tenendo conto dell’energia per l’espulsione di ioni H⁺)

Complesso I:

NADH + H⁺ + Q → NAD⁺ + QH₂
ΔE’° = 0,045 – (– 0,320) = 0,365 volts;
ΔG’° = – 2 × 96,5 × 0,365 = – 70,4 kJ/mol

Complesso II:

FADH₂ + Q → FAD + QH₂
ΔE’° = 0,045 – 0,0 = 0,045 volts;
ΔG’° = – 2 × 96,5 × 0,045 = – 8.7 kJ/mol

Termodinamica della catena di trasporto degli elettroni (non tenendo conto dell’energia per l’espulsione di ioni H⁺)

Complesso III:

QH₂ + 2 Cit. c_ox → Q + 2 Cit. c_red + 2 H⁺
ΔE’° = 0,254 – 0,045 = 0,209 volts;
ΔG’° = – 2 × 96,5 × 0,209 = – 40,3 kJ/mol

Complesso IV:

2 Cit. c_red + 2 H⁺ + 1/2 O₂ → 2 Cit. c_ox + H₂O
ΔE’° = 0,816 – 0,254 = 0,562 volts;
ΔG’° = – 2 × 96,5 × 0,562 = – 108,5 kJ/mol

Struttura di F₁

Costituita da 9 subunità con composizione α₃ β₃ γ δ ε.

F₁ ha la forma di un pomello con le 3 subunità α alternate alle 3 β disposte intorno all’asta del pomello (stelo) costituito dalla subunità γ.

Le subunità δ ε sono elementi di connessione con F_o.

Il sito di legame per il nucleotide (ATP o ADP) si trova sulla subunità β, all’interfaccia con la subunità α.

Le 3 subunità β, in seguito al legame della subunità γ, assumono conformazioni diverse:

• β–ATP, cataliticamente attiva e con elevata affinità per ATP
• β–ADP, inattiva con affinità intermedia per il nucleotide
• β–vuota, con nessuna affinità per i nucleotidi

Durante il ciclo di formazione dell’ATP, queste tre conformazioni si alternano in relazione all’interazione della subunità δ con una delle 3 subunità β (subunità vuota).

Struttura di F_o

F_o è costituita da 3 subunità di tipo α, β, e γ (α, β₂, γ_10-12)

Il nucleo principale di F_o è costituito da 10 o 12 subunità γ, ognuna organizzata in 2 α-eliche transmembrana, disposte in cerchi concentrici.

Il cilindro formato dalle subunità γ circonda lo stelo costituito dalla subunità δ e ε di F₁. In tal modo la subunità δ di F₁ è perpendicolare alla base del cilindro.

Le 2 subunità β di F_o interagiscono con la subunità δ di F₁ costituendo elemento di connessione tra F_o ed F₁ in grado di fungere da “blocca-pomello”.

In tal modo quando il cilindro γ₁₀ ruota per effetto del flusso protonico, anche l’asta δ ε ruota , mentre il pomello α₃β₃ resta bloccato dal “blocca-pomello” β₂.

Stechiometria della fosforilazione ossidativa

Ora che il modello chemiosmotico è stato definitivamente accettato, è stata rimessa in discussione la stechiometria di questa reazione:

× ADP + ×  P_i + 1/2 O₂ + H⁺ + NADH → ×  ATP + H₂O + NAD⁺

Il coefficiente ×  della reazione, anche indicato come rapporto P/O o P/2e^– rappresenta quante moli di ATP sono sintetizzate dall’ATP sintasi per mole di coppia di elettroni trasportate dal trasportatore (NADH o FADH₂).

Questo rapporto è stato quindi rideterminato in mitocondri isolati e stimolati a produrre ATP.

Numero di ioni H⁺ espulsi per molecola di trasportatore elettronico:

• NADH comporta l’efflusso di 10 H⁺
• FADH₂ comporta l’efflusso di 6 H⁺

Per la sintesi di una molecola di ATP è necessario l’afflusso di 4 ioni H⁺, pertanto:

• NADH comporta sintesi di 2.5 molecole di ATP
• FADH₂ comporta sintesi di 1.5 molecole di ATP