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Franca Esposito » 18.Fosforilazione ossidativa


Fosforilazione ossidativa

La fosforilazione ossidativa è il processo centrale del metabolismo energetico di tutti gli organismi aerobi con cui si sintetizza gran parte dell’ATP necessario ai processi vitali.

Negli eucarioti la fosforilazione ossidativa avviene nei mitocondri.

La degradazione dei carboidrati, acidi grassi ed amminoacidi produce coenzimi ridotti (NADH e FADH2), ricchi di energia.

NADH e FADH2 a livello della membrana mitocondriale interna, cedono gli elettroni ad una catena di trasporto di elettroni che ha come accettore finale l’ossigeno atmosferico che viene ridotto ad H2O (respirazione cellulare).

Durante tale processo parte dell’energia contenuta nei coenzimi ridotti è utilizzata per la sintesi di ATP a partire da ADP e Pi.

La lezione è della Prof. Margherita Ruoppolo

Morfologia del mitocondrio

La membrana mitocondriale esterna è permeabile agli ioni e a molecole di piccole dimensioni (Mr < 5000).

La membrana interna è permeabile solo ad O2, H2O e CO2. Funziona da separatore tra le attività metaboliche mitocondriali e citosoliche.

Presenta molte invaginazioni che ne aumentano la superficie.

Tra la membrana interna e la esterna c’è lo spazio intermembranario.

Lo spazio racchiuso dalla membrana mitocondriale interna è chiamato matrice mitocondriale.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Contenuto ed attività del mitocondrio

All’interno della matrice mitocondriale si verificano processi catabolici, infatti nella matrice sono localizzati:

  • complesso della piruvato deidrogenasi
  • enzimi del ciclo di Krebs
  • enzimi della β-ossidazione degli acidi grassi
  • enzimi della degradazione degli amminoacidi

La catena di trasporto degli elettroni (catena respiratoria) è in gran parte costituita da proteine integrali (complessi I-IV, ATP sintasi FoF1) ancorate alla membrana mitocondriale interna tranne il citocromo c, idrosolubile, localizzato nello spazio intermembrana.

Trasporto attraverso membrana mitocondriale

Il passaggio dei metaboliti attraverso la membrana mitocondriale interna avviene grazie alla presenza nella membrana di trasportatori specifici.

Necessitano di trasportatori specifici:

  • piruvato (prodotto finale della glicolisi)
  • acidi grassi
  • amminoacidi e alcuni loro derivati α-chetoacidi
  • ADP e Pi (in ingresso)
  • ATP ( in uscita)

Il NADH e il NADPH, nonché i coenzimi flavinici legati alle flavoproteine, non possono attraversare la membrana mitocondriale interna e cedono i propri equivalenti riducenti ad altri trasportatori localizzati nella membrana.

Flusso degli elettroni

Il NADH (citosolico o mitocondriale) cede i suoi equivalenti riducenti al complesso I, mentre il FADH2 rilascia gli elettroni al complesso II della catena respiratoria.

Il flusso degli elettroni a partire dal NADH/FADH2 è determinato da reazioni di ossido-riduzione, regolate quindi dai valori di DE’° che si ottengono dalle semicoppie redox lungo la catena.

I complessi proteici della catena respiratoria (I-IV) e il citocromo c contengono gruppi prostetici in grado di accettare o donare elettroni.

Il coenzima Q, componente non proteico, accetta elettroni dai complessi I e II e li trasferisce al complesso III.

Modificato da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Modificato da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Catena respiratoria: Complesso I

Il Complesso I, costituito da più di 43 catene peptidiche, un FMN ed almeno 6 centri Fe–S; catalizza una serie di reazioni in cui gli elettroni del NADH sono trasferiti all’ubichinone (Q).

Per tale motivo il Complesso I viene anche chiamato NADH:ubichinone ossidoreduttasi o NADH deidrogenasi.

I due elettroni trasportati dal NADH passano prima all’ FMN e, dopo una serie di passaggi mediati da centri Fe–S, arrivano all’ultima proteina Fe–S del braccio corto, chiamata N–2.

Gli elettroni passano poi nel braccio lungo a Q che, diventato QH2, diffonde liberamente nella membrana mitocondriale.

Proteine con centri ferro-zolfo

Contengono centri ferro-zolfo in cui uno o più atomi di ferro sono coordinati da atomi di zolfo provenienti da residui di Cys e/o da atomi di zolfo inorganico.

Una variante è costituita dalle proteine ferro-zolfo di Rieske in cui alla coordinazione del ferro contribuiscono anche residui di His.

Per tutte le proteine ferro-zolfo (almeno 8 coinvolte nella catena respiratoria) il trasporto degli elettroni è assicurato dal differente stato di ossidazione del ferro (Fe2+ e Fe3+).

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Complesso II

Il Complesso II, costituito da 4 subunità peptidiche (A → D) e 5 gruppi prostetici, ha una porzione transmembranica (subunità C e D) ed una estensione rivolta verso la matrice (subunità A e B).

La subunità A è la succinato deidrogenasi (enzima del ciclo di Krebs), che accoglie il substrato succinato ed a cui è legato covalentemente il FAD, mentre la subunità B contiene tre centri 2Fe–2S.

La parte transmembranica è costituita dalle proteine integrali di membrana C e D, a cui sono legati un eme di tipo b e l’ubichinone, accettore finale di elettroni.

L’eme b non interviene nel trasporto degli elettroni, ma ha un ruolo protettivo: previene la fuoriuscita accidentale di elettroni, che in presenza di O2 possono portare alla formazione di ROS (specie reattive dell’ossigeno: O2–•, H2O2).

Il Complesso II viene chiamato anche succinato: ubichinone ossidoreduttasi o succinato deidrogenasi.

Ubichinone

L’ubichinone (o coenzima Q), contiene un anello benzochinonico e una catena laterale isoprenoide.

Le sue caratteristiche idrofobiche e le piccole dimensioni fanno sì che esso sia mobile all’interno della membrana mitocondriale, in cui diffonde liberamente.

La forma ossidata dell’ubichinone (Q) può trasformarsi in due forme ridotte, accettando:

  • 1 e ed 1 ione H+:  semichinone radicalico (QH)
  • 2 e e 2 ioni H+:  ubichinolo (QH2)
Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Citocromi

I citocromi del mitocondrio sono emoproteine raggruppate in tre famiglie distinte (citocromi a, b oppure c) in base al tipo di eme.

Il citocromo c è solubile e perciò libero di muoversi nella spazio intermembranario (tra membrana esterna ed interna).

I citocromi a, a3, b e c1 invece sono legati alla membrana mitocondriale interna; alcuni sono rivolti verso lo spazio intermembranario.

I citocromi sono trasportatori di elettroni, grazie al differente stato di ossidazione del ferro (Fe2+ e Fe3+) presente nell’eme.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Complesso I

La serie di reazioni del Complesso I può essere schematizzata in due processi accoppiati e simultanei.

1. Trasferimento esoergonico all’ubichinone (Q) di un H dal NADH e di un H+ dal solvente della matrice (2 ioni H+ e 2 e):

NADH + H+ + Q → NAD+ + QH2

2. Espulsione endoergonica di 4 ioni H+ dalla matrice verso lo spazio intermembrana:

4 H+matrice 4 H+intermembr.

L’intero processo è esoergonico (vettoriale: matrice intermembr.) ed il Complesso I funziona quindi come una pompa di protoni:

NADH + 5 H+matrice + Q NAD+ + QH2 + 4 H+intermembr.

In seguito alla perdita dei protoni la matrice acquisisce una carica negativa, mentre lo spazio intermembrana si carica positivamente (per ogni coppia di elettroni trasportata dal NADH la matrice espelle 4 H+).

Questo flusso di protoni crea un potenziale elettrochimico tra i due lati della membrana mitocondriale che sarà poi utilizzato per la sintesi di ATP.

Vie alternative di formazione dell’ubichinolo

Il QH2 si forma anche attraverso altre due reazioni:

  • navetta del glicerolo 3-fosfato: QHsi forma d operqa del flavoenzima glicerolo 3-fosfato deidrogenasi
  • β-ossidazione degli acidi grassi

I tappa: l’azione dell’acil-CoA deidrogenasi forma FADH2 i cui elettroni passano alla proteina che trasferisce elettroni (ETF) e quindi all’ ETF: Q ossidoreduttasi che riduce l’ubichinone (QH2).

Quindi QH2 si forma attraverso 4 reazioni diverse.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Complesso III

Contiene 11 subunità diverse, di cui quattro con ruolo funzionale: il citocromo b562, il citocromo b566, il citocromo c1 e una proteina Fe–S di Rieske (la forma attiva è dimerica: 22 proteine).

Il Complesso III accetta gli elettroni trasportati da QH2 e li trasferisce al trasportatore idrosolubile citocromo c.

Il Complesso III viene anche chiamato ubichinone: citocromo c ossidoreduttasi oppure complesso del citocromo bc1.

Come per il Complesso I, nel Complesso III il trasferimento di elettroni da QH2 al citocromo c è accoppiato al trasporto vettoriale di ioni H+ dalla matrice verso lo spazio intermembrana.

La reazione complessiva catalizzata dal Complesso III è quindi:

QH2 + 2 Cit. c(Fe3+) + 2 H+matrice → Q + 2 Cit. c(Fe2+) + 4 H+intermembr.

Anche in questo caso quindi il flusso protonico crea ai lati della membrana il potenziale elettrochimico per la sintesi dell’ATP.

Complesso IV

Anche il Complesso IV è legato alla membrana mitocondriale, con una porzione che protrude nello spazio intermembrana.

E’ costituito da 13 subunità, di cui 3 cruciali per la funzione:

  • subunità I (centrale) con due gruppi eme a e a3 ed uno ione Cu (CuB)
  • subunità II (destra) con altri due ioni Cu (centro binucleare CuA)
  • subunità III (sinistra) con ruolo oscuro

Il complesso IV, chiamato anche citocromo ossidasi, è l’ultimo componente della catena respiratoria e trasferisce gli elettroni dal citocromo c all’O2 riducendolo ad H2O.

Inoltre, accoppiata a questa reazione di ossido-riduzione c’è l’espulsione di altri 4 ioni H+ dalla matrice.

Complesso IV (segue)

Attenzione alla stechiometria del Complesso IV

Per ogni coppia di e (2 cit. c) si ha espulsione di 2 H+ dalla matrice.

Per la riduzione dell’O2 a 2 molecole di H2O sono necessari 4 e (4 cit. c) oltre ai 4 ioni H+ della matrice.

Quindi, se si tiene conto della stechiometria del Complesso III (da cui si ottengono 2 cit. c ridotti) la reazione complessiva del Complesso IV è:

2 Cit. cred + 4 H+matrice + 1/2 O2 → 2 Cit. cox + H2O + 2 H+intermembr.

Se invece si considera la riduzione di 1 molecola di O2:

4 Cit. cred + 8 H+matrice + O2 4 Cit. cox + 2 H2O + 4 H+intermembr.

Anche dalla reazione catalizzata dal Complesso IV si crea un flusso di protoni (potenziale elettrochimico) utilizzabile per la sintesi di ATP.

Termodinamica della catena di trasporto degli elettroni (non tenendo conto dell’energia per l’espulsione di ioni H+)

Complesso I:

NADH + H+ + Q → NAD+ + QH2
ΔE’° = 0,045 – (– 0,320) = 0,365 volts;
ΔG’° = – 2 × 96,5 × 0,365 = – 70,4 kJ/mol

Complesso II:

FADH2 + Q → FAD + QH2
ΔE’° = 0,045 – 0,0 = 0,045 volts;
ΔG’° = – 2 × 96,5 × 0,045 = – 8.7 kJ/mol

Termodinamica della catena di trasporto degli elettroni (non tenendo conto dell’energia per l’espulsione di ioni H+)

Complesso III:

QH2 + 2 Cit. cox → Q + 2 Cit. cred + 2 H+
ΔE’° = 0,254 – 0,045 = 0,209 volts;
ΔG’° = – 2 × 96,5 × 0,209 = – 40,3 kJ/mol

Complesso IV:

2 Cit. cred + 2 H+ + 1/2 O2 → 2 Cit. cox + H2O
ΔE’° = 0,816 – 0,254 = 0,562 volts;
ΔG’° = – 2 × 96,5 × 0,562 = – 108,5 kJ/mol

Forza motrice protonica

Se la catena di trasporto degli elettroni inizia dal Complesso I (dal NADH), la reazione complessiva (inclusa l’espulsione di H+) è:

NADH + 11 H+matrice + 1/2 O2 → NAD+ + H2O + 10 H+intermememb.

Se invece si parte dal Complesso II (dal succinato e quindi dal FADH2) la reazione complessiva (inclusa l’espulsione di H+) è:

FADH2 + 6 H+matrice + 1/2 O2 FAD + H2O + 6 H+intermememb.


Forza motrice protonica

L’espulsione dei protoni genera un’energia elettrochimica tra i due lati della membrana mitocondriale interna sulla base della differenza di [H+] (DpH ≈ 0.75) e della separazione di cariche (DE ≈ 0.17 volts).

L’energia generata dall’espulsione di 1 mole di H+ è:

DG = 2,3 × R x T x DpH + F x DE =20 kJ/mol

Quindi dal trasferimento di 2 e dal NADH all’O2 (1/2 mole) si ricavano 219 kJ/mol.

L’energia derivata dal gradiente di pH (DpH) e dal potenziale elettrochimico (DE), detta anche forza motrice protonica, è sfruttata per produrre ATP.

La sintesi di ATP avviene in presenza di gradiente H+ anche senza catena di trasporto.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Teoria chemiosmotica per la sintesi di ATP

I trasportatori di membrana (complessi I-IV) mediano il flusso esoergonico di elettroni, che porta alla riduzione di O2 ad H2O.

Tale flusso è accoppiato al trasporto endoergonico di ioni H+ nello spazio intermembrana, generando la forza motrice protonica.

Questa fornisce l’energia necessaria per la sintesi di ATP (fosforilazione ossidativa) attraverso un complesso chiamato ATP sintasi o complesso FoF1.

La teoria chemiosmotica prevede che la sintesi dell’ATP (reazione chimica) sia rigorosamente accoppiata al processo di ritorno dei protoni all’interno della matrice (osmosi).

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Sintesi di ATP accoppiata al consumo di O2

La sintesi dell’ATP da ADP e Pi, è possibile solo se c’è consumo di ossigeno (respirazione cellulare mitocondriale), come dimostrato da esperimenti in vitro:

(A) Mitocondri isolati iniziano a sintetizzare ATP solo in presenza di un substrato ossidabile (succinato); allo stesso tempo si registra consumo di O2.

(A) Inibendo la catena di trasporto degli elettroni (CN– inibisce il Complesso IV), si blocca anche la sintesi di ATP.

(B) Inibendo la sintesi di ATP (oligomicina o venturicidina inibiscono ATP sintasi), si blocca anche il consumo di O2.

(B) Solo un disaccoppiante, dini-trofenolo (DNP) blocca la sintesi di ATP ma non il consumo di O2.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


ATP sintasi (Complesso V)

L’ATP sintasi è costituita da due componenti separabili:

  • Fo proteina integrale di membrana; canale per il rientro dei protoni dallo spazio intermembrana alla matrice
  • F1 proteina estrinseca legata ad Fo rivolta verso la matrice; catalizza la sintesi di ATP (separata da Fo funziona solo come ATPasi)

Il sito di legame di F1 per l’ATP (e per ADP e Pi) possiede un’affinità per l’ATP superiore a quella per l’ADP.

Ciò abbassa notevolmente l’energia libera richiesta per la sintesi di ATP a partire da ADP e Pi sulla superficie di F1.

DG’° ≈ 0 (invece di + 30,5 kJ/mol)

Quindi l’energia libera derivante dalla forza motrice protonica è utilizzata per il rilascio di ATP da F1.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Struttura di F1

Costituita da 9 subunità con composizione αβγ δ ε.

F1 ha la forma di un pomello con le 3 subunità α alternate alle 3 β disposte intorno all’asta del pomello (stelo) costituito dalla subunità γ.

Le subunità δ ε sono elementi di connessione con Fo.

Il sito di legame per il nucleotide (ATP o ADP) si trova sulla subunità β, all’interfaccia con la subunità α.

Le 3 subunità β, in seguito al legame della subunità γ, assumono conformazioni diverse:

  • β–ATP, cataliticamente attiva e con elevata affinità per ATP
  • β–ADP, inattiva con affinità intermedia per il nucleotide
  • β–vuota, con nessuna affinità per i nucleotidi

Durante il ciclo di formazione dell’ATP, queste tre conformazioni si alternano in relazione all’interazione della subunità δ con una delle 3 subunità β (subunità vuota).

Struttura di Fo

Fo è costituita da 3 subunità di tipo α, β, e γ (α, β2, γ10-12)

Il nucleo principale di Fo è costituito da 10 o 12 subunità γ, ognuna organizzata in 2 α-eliche transmembrana, disposte in cerchi concentrici.

Il cilindro formato dalle subunità γ circonda lo stelo costituito dalla subunità δ e ε di F1. In tal modo la subunità δ di F1 è perpendicolare alla base del cilindro.

Le 2 subunità β di Fo interagiscono con la subunità δ di F1 costituendo elemento di connessione tra Fo ed F1 in grado di fungere da “blocca-pomello”.

In tal modo quando il cilindro γ10 ruota per effetto del flusso protonico, anche l’asta δ ε ruota , mentre il pomello α3β3 resta bloccato dal “blocca-pomello” β2.

Catalisi rotazionale dell’ATP sintasi

Il meccanismo di catalisi prevede la rotazione della subunità δ, e si basa sul fatto che essa può legarsi solo a β-vuota.

Ruotando di 120° alla volta, la subunità δ provoca l’alternanza delle conformazioni in α3β3.

In seguito alla rotazione, δ viene a trovarsi vicino a β–ATP, che perciò è modificata in β–vuota.

Ciò provoca l’espulsione di ATP e la modifica delle conformazioni adiacenti: β–ADP diventa β–ATP, mentre β–vuota diventa β–ADP.

Così ADP e Pi, già legati al nuovo sito β–ATP, sono convertiti in ATP, mentre altro ADP e Pi si legano al nuovo sito β–ADP.

Quindi, dopo una rotazione completa di 360°, saranno rese disponibili 3 molecole di ATP.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed. Zanichelli.


Stechiometria della fosforilazione ossidativa

Ora che il modello chemiosmotico è stato definitivamente accettato, è stata rimessa in discussione la stechiometria di questa reazione:

× ADP + ×  Pi + 1/2 O2 + H+ + NADH → ×  ATP + H2O + NAD+

Il coefficiente ×  della reazione, anche indicato come rapporto P/O o P/2e rappresenta quante moli di ATP sono sintetizzate dall’ATP sintasi per mole di coppia di elettroni trasportate dal trasportatore (NADH o FADH2).

Questo rapporto è stato quindi rideterminato in mitocondri isolati e stimolati a produrre ATP.

Numero di ioni H+ espulsi per molecola di trasportatore elettronico:

  • NADH comporta l’efflusso di 10 H+
  • FADH2 comporta l’efflusso di 6 H+

Per la sintesi di una molecola di ATP è necessario l’afflusso di 4 ioni H+, pertanto:

  • NADH comporta sintesi di 2.5 molecole di ATP
  • FADH2 comporta sintesi di 1.5 molecole di ATP
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