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Franca Esposito » 3.Proteine specializzate d'interesse biomedico: Emoglobina

Emoglobina – Hb

- E’ contenuta negli eritrociti circolanti nel sangue:

≈ 3 • 108 molecole di Hb/eritrocita
4.2 ÷ 5.6 • 106 Eritrociti/ml sangue

≈ 6 litri = Volume totale sangue 2.5 ÷ 3.3 • 1013 = N.totale eritrociti

Hb = 12 ÷ 17.5 g/100 ml

Hb/6lt = 620 ÷ 1050 g

Lezione della Prof. Patrizia Carandente Giarrusso

Eritrociti umani. Immagine autoprodotta.

Hb e O₂

Hb incrementa di circa 50-70 volte la capacità di trasporto di O₂ in un litro di sangue
Hb lega O₂ a livello degli alveoli polmonari e lo trasporta ai tessuti periferici attraverso il circolo sanguigno
Interviene nel trasporto di CO₂ e di ioni H⁺ in senso inverso

Hb e Mb

Mioglobina/Mb: 1catena polipeptica + 1 eme
Emoglobina/Hb:4 catene polipetidiche + 4 eme

La presenza di 4 catene e 4 eme, ciascuna con caratteristiche analoghe a quella di Mb, comporta per Hb proprietà molto diverse rispetto ad Mb.

Hb struttura

Prima proteina oligomerica di cui è stata stabilita la struttura mediante analisi ai Raggi X.

Classico esempio di come modifiche conformazionali della struttura quaternaria possano regolare la funzione biologica della proteina PM = 68000 dalton.

Struttura quaternaria: Tetramero

4 catene = 2 α (141 aa) e 2 β (146 aa)
4 gruppi eme

Hb struttura (segue)

Catena α e β simili ma distinte per sequenza
Forma quasi sferica e compatta, elevata simmetria
Catene molto vicine tra di loro
Gruppi eme posti in cavita’ idrofobiche ma accessibili dall’esterno
Siti di legame per O₂ lontani tra loro

Hb struttura (segue)

Immagine autoprodotta.

Confronto struttura Hb e Mb

RIPIEGAMENTO GLOBINICO

Le subunità dell’Hb sono strutturalmente simili all’Mb

La struttura secondaria e terziaria della catena β di Hb e di Mb sono molto simili…

Immagine autoprodotta.

Confronto struttura Hb e Mb

… Pur non avendo elevata omologia di sequenza aminoacidica!!!

Sequenze diverse possono specificare strutture tridimensionali molto simili
E’evidente che il ripiegamento globinico assume un significato biologico importante
Esso è in comune a tutte le Mb e Hb dei vertebrati e consente il legame reversibile con O₂

Tratto da: DL Nelson e MM Cox "I Principi di biochimica di Lehninger" ed.Zanichelli.

Sintesi di catene globiniche

Immagine autoprodotta.

Curva di saturazione di Hb

La curva di saturazione di Hb con O₂ ha un andamento sigmoidale, indicativo della presenza di più stati di Hb a differente affinità per il ligando.

All’aumentare della pO₂ il gas viene legato con affinità sempre più elevata.

K_d = p₅₀ = 26 mm Hg

Il legame di O₂ all’eme di una subunità di Hb facilita il legame di altre molecole di O₂ ai gruppi eme delle altre subunità

↓

EFFETTO COOPERATIVO POSITIVO

Immagine autoprodotta.

Saturazione Hb

Saturazione Hb (segue)

Origine e significato

La curva di saturazione è la risultante dei due diversi stati di Hb :

stato T a bassa affinità
stato R ad alta affinità

L’effetto cooperativo facilita il passaggio dalla bassa all’alta affinità ed il trasporto di O₂ viene quasi raddoppiato.

Nei polmoni: saturazione di Hb con O₂ = 98%

Nel sangue venoso: saturazione di Hb con O₂ = 60%

Nel muscolo in attività: saturazione di Hb con O₂ = 33%

Tratto da: DL Nelson e MM Cox "I Principi di biochimica di Lehninger" ed.Zanichelli.

Confronto curve di saturazione Mb ed Hb

Nel sangue arterioso la pO₂ è tale che Hb risulta quasi completamente di O₂
Nel sangue venoso la pO₂ si abbassa e la saturazione di Hb scende a circa il 60%

A questi valori di pO₂ quindi Hb cede parte dell’ossigeno, che diffonde nei liquidi extracellulari e trova Mb nei muscoli. Essendo più affine di Hb, Mb si satura quasi completamente di O₂.

Tratto da RH Garrett, CM Grisham:"Biochimica" Zanichelli.

Hb: Proteina allosterica

La sua struttura quaternaria può subire modifiche conformazionali ad opera di ligandi detti MODULATORI ALLOSTERICI.

Modulatore può essere:

Omotropico
Ligando (O₂) funge anche da modulatore

Eterotropico
Ligando e modulatore sono molecole diverse

Modulatore può essere:

positivo o negativo

Variazioni funzionali della proteina svolgono:

Importante meccanismo di controllo dell’attività biologica

Hb Modulatore Omotropico: O₂

Nell’Hb troviamo due diversi tipi d’interazioni tra catene α e β:

Interazioni forti che generano dimeri funzionali α₁β₁, α₂β₂, non cambiano con l’ossigenazione e coinvolgono circa 30 aa (zone blu)
Interazioni : α₂β₁ , α₁β₂

Regioni di scorrimento o contatto dei due dimeri funzionali che coinvolgono 19 aa, le cui posizioni relative sono modificate nell’ossigenazione (zone gialle).

Tratto da RH Garrett, CM Grisham:"Biochimica" Zanichelli.

deossiHb e HbO₂

Hb deossigenata

STRUTTURA QUATERNARIA: FORMA T

molecola rigida
minore affinita’ per O₂

Hb ossigenata

STRUTTURA QUATERNARIA: FORMA R

molecola meno rigida
maggiore affinita’ per O₂

deossiHb

deossiHb presenta legami salini che le conferiscono rigidità e contribuiscono alla stabilizzazione della forma T. Tratta da: DL Nelson e MM Cox "I Principi di biochimica di Lehninger" ed.Zanichelli.

Passaggio da deossi Hb (T) a HbO₂ (R)

Quando O₂ si lega al gruppo eme il ferro, spostandosi verso il piano dell’eme, porta His F8 nella stessa direzione.

Il movimento della HisF8 comporta un movimento dell’α-elica F ed alcuni residui (Leu e Val) cambiano posizione (il movimento si trasmette a distanza).

Tratto da RH Garrett, CM Grisham:"Biochimica", Zanichelli.

Passaggio da deossi Hb (T) a HbO₂ (R)

Il legame con l’O₂, quindi coinvolge l’interfaccia tra le subunità, regioni contatto, provocando la rottura dei ponti salini e di ponti H

↓

MODIFICAZIONE CONFORMAZIONALE

Passaggio da deossi Hb (T) a HbO₂ (R) (segue)

Le regioni di contatto α₂β₁ ed α₁β₂ fungono da interruttore per il passaggio dalla forma T alla forma R.
In seguito all’ossigenazione, la coppia di subunita’ α₁β₁ ruota di 15 gradi rispetto α₂β₂

Immagine autoprodotta.

Passaggio da deossi Hb (T) a HbO₂ (R) (segue)

Il legame della prima molecola di O₂ è energeticamente più sfavorito dal numero di legami da rompere, da cui l’aumento sequenziale dell’affinità per l’O₂ (sigmoide).

Le molecole di O₂ non si legano all’Hb in modo indipendente l’una dall’altra, ma con un legame di tipo cooperativo positivo.

In tal modo il trasporto di O₂ è aumentato di circa due volte rispetto ad un legame non cooperativo.

Il legame di O₂ al ferro dei gruppi eme, collegando tra di loro parti lontane della molecola di Hb, induce il passaggio di Hb dalla forma:

T (Tesa) → R (Rilasciata)

Modulatori allosterici di Hb

Oltre l’O₂ che funge da modulatore omotropico positivo, Hb ha anche modulatori eterotropici:

[H⁺]
eliminazione CO₂ metabolica
legame del 2,3 bis-fosfoglicerato

Immagine autoprodotta.

Trasporto isoidrico

CO₂ nel globulo rosso è trasportata sotto forma di HCO_3-^-.

Modulatori allosterici di Hb

Effetto Bohr
Gli ioni H⁺ che si dissociano da H₂CO₃ si legano all’HbO₂ e la inducono a liberare O₂ che diffonde dagli eritrociti alle cellule

HbO₂ + H ⁺ ↔ HbH⁺ + O₂

A valori più bassi di pH ( > [H⁺] ) l’affinità di Hb per O₂ diminuisce.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox "I Principi di Biochimica di Lehninger" ed.Zanichelli.

Modulatori allosterici di Hb (segue)

Effetto Bohr

Per ogni O₂ liberato si legano 0.5 eq H⁺
Per assumere H⁺ alcuni siti di Hb aumentano l’affinità nei confronti di tali ioni
Nel passaggio di HbO₂ ad Hb il pK_a di alcuni gruppi cambia
I residui coinvolti sono: His 146 β , His 122α, gruppo α-aminico catene α (pKa tra 6-8)
< pH porta ad > grado di protonazione favorendo la formazione di coppie ioniche che stabilizzano la forma Hb

Trasporto di CO₂

La CO₂ e’ trasportata anche da Hb
Sotto forma di carbammato, per interazione con i gruppi α- aminici non ionizzati, estremità aminoterminale di ciascuna catena globinica:

RNH₂ + CO₂ ↔ R-NH-COO^- + H⁺

Si generano così H⁺ che favoriscono l’effetto Bohr.

Si generano interazioni elettrostatiche che diminuiscono l’affinità di Hb per O₂, stabilizzando la forma T.