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Franca Esposito » 3.Proteine specializzate d'interesse biomedico: Emoglobina


Emoglobina – Hb

- E’ contenuta negli eritrociti circolanti nel sangue:

≈ 3 • 108 molecole di Hb/eritrocita
4.2 ÷ 5.6 • 106 Eritrociti/ml sangue

≈ 6 litri = Volume totale sangue 2.5 ÷ 3.3 • 1013 = N.totale eritrociti

Hb = 12 ÷ 17.5 g/100 ml

Hb/6lt = 620 ÷ 1050 g

Lezione della Prof. Patrizia Carandente Giarrusso

Eritrociti umani.              Immagine autoprodotta.

Eritrociti umani. Immagine autoprodotta.


Hb e O2

  • Hb incrementa di circa 50-70 volte la capacità di trasporto di O2 in un litro di sangue
  • Hb lega O2 a livello degli alveoli polmonari e lo trasporta ai tessuti periferici attraverso il circolo sanguigno
  • Interviene nel trasporto di CO2 e di ioni H+ in senso inverso

Hb e Mb

  • Mioglobina/Mb: 1catena polipeptica + 1 eme
  • Emoglobina/Hb:4 catene polipetidiche + 4 eme

La presenza di 4 catene e 4 eme, ciascuna con caratteristiche analoghe a quella di Mb, comporta per Hb proprietà molto diverse rispetto ad Mb.

Hb struttura

Prima proteina oligomerica di cui è stata stabilita la struttura mediante analisi ai Raggi X.

Classico esempio di come modifiche conformazionali della struttura quaternaria possano regolare la funzione biologica della proteina PM = 68000 dalton.

Struttura quaternaria: Tetramero

  •  4 catene = 2 α (141 aa) e 2 β (146 aa)
  •  4 gruppi eme

Hb struttura (segue)

  • Catena α e β simili ma distinte per sequenza
  • Forma quasi sferica e compatta, elevata simmetria
  • Catene molto vicine tra di loro
  • Gruppi eme posti in cavita’ idrofobiche ma accessibili dall’esterno
  • Siti di legame per O2 lontani tra loro

Hb struttura (segue)

 Immagine autoprodotta.

Immagine autoprodotta.


Confronto struttura Hb e Mb

RIPIEGAMENTO GLOBINICO

Le subunità dell’Hb sono strutturalmente simili all’Mb

La struttura secondaria e terziaria della catena β di Hb e di Mb sono molto simili…

Immagine autoprodotta.

Immagine autoprodotta.


Confronto struttura Hb e Mb

… Pur non avendo elevata omologia di sequenza aminoacidica!!!

  • Sequenze diverse possono specificare strutture tridimensionali molto simili
  • E’evidente che il ripiegamento globinico assume un significato biologico importante
  • Esso è in comune a tutte le Mb e Hb dei vertebrati e consente il legame reversibile con O2
Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed.Zanichelli.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox "I Principi di biochimica di Lehninger" ed.Zanichelli.


Sintesi di catene globiniche

 Immagine autoprodotta.

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Curva di saturazione di Hb

La curva di saturazione di Hb con O2 ha un andamento sigmoidale, indicativo della presenza di più stati di Hb a differente affinità per il ligando.

All’aumentare della pO2 il gas viene legato con affinità sempre più elevata.

Kd = p50 = 26 mm Hg

Il legame di O2 all’eme di una subunità di Hb facilita il legame di altre molecole di O2 ai gruppi eme delle altre subunità

EFFETTO COOPERATIVO POSITIVO

 Immagine autoprodotta.

Immagine autoprodotta.


Saturazione Hb


 Saturazione Hb (segue)

Origine e significato

La curva di saturazione è la risultante dei due diversi stati di Hb :

  • stato T a bassa affinità
  • stato R ad alta affinità

L’effetto cooperativo facilita il passaggio dalla bassa all’alta affinità ed il trasporto di O2 viene quasi raddoppiato.

Nei polmoni: saturazione di Hb con O2 = 98%

Nel sangue venoso: saturazione di Hb con O2 = 60%

Nel muscolo in attività: saturazione di Hb con O2 = 33%

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed.Zanichelli.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox "I Principi di biochimica di Lehninger" ed.Zanichelli.


Confronto curve di saturazione Mb ed Hb

  • Nel sangue arterioso la pO2 è tale che Hb risulta quasi completamente di O2
  • Nel sangue venoso la pO2 si abbassa e la saturazione di Hb scende a circa il 60%

A questi valori di pO2 quindi Hb cede parte dell’ossigeno, che diffonde nei liquidi extracellulari e trova Mb nei muscoli. Essendo più affine di Hb, Mb si satura quasi completamente di O2.

Tratto da RH Garrett, CM Grisham:”Biochimica”  Zanichelli.

Tratto da RH Garrett, CM Grisham:"Biochimica" Zanichelli.


Hb: Proteina allosterica

La sua struttura quaternaria può subire modifiche conformazionali ad opera di ligandi detti MODULATORI ALLOSTERICI.

Modulatore può essere:

Omotropico
Ligando (O2) funge anche da modulatore

Eterotropico
Ligando e modulatore sono molecole diverse

Modulatore può essere:

  • positivo o negativo

Variazioni funzionali della proteina svolgono:

Importante meccanismo di controllo dell’attività biologica

Hb Modulatore Omotropico: O2

Nell’Hb troviamo due diversi tipi d’interazioni tra catene α e β:

  1. Interazioni forti che generano dimeri funzionali α1β1, α2β2, non cambiano con l’ossigenazione e coinvolgono circa 30 aa (zone blu)
  2. Interazioni : α2β1 , α1β2

Regioni di scorrimento o contatto dei due dimeri funzionali che coinvolgono 19 aa, le cui posizioni relative sono modificate nell’ossigenazione (zone gialle).

Tratto da RH Garrett, CM Grisham:”Biochimica”  Zanichelli.

Tratto da RH Garrett, CM Grisham:"Biochimica" Zanichelli.


deossiHb e HbO2

Hb deossigenata 

STRUTTURA QUATERNARIA: FORMA T

  • molecola rigida
  • minore affinita’ per O2

Hb ossigenata 

STRUTTURA QUATERNARIA: FORMA R

  • molecola meno rigida
  • maggiore affinita’ per O2

deossiHb

deossiHb presenta  legami salini che le conferiscono rigidità e contribuiscono alla stabilizzazione della  forma T. 
Tratta da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di biochimica di Lehninger” ed.Zanichelli.

deossiHb presenta legami salini che le conferiscono rigidità e contribuiscono alla stabilizzazione della forma T. Tratta da: DL Nelson e MM Cox "I Principi di biochimica di Lehninger" ed.Zanichelli.


Passaggio da deossi Hb (T) a HbO2 (R)

Quando O2 si lega al gruppo eme il ferro, spostandosi verso il piano dell’eme, porta His F8 nella stessa direzione.

Il movimento della HisF8 comporta un movimento dell’α-elica F ed alcuni residui (Leu e Val) cambiano posizione (il movimento si trasmette a distanza).

Tratto da RH Garrett, CM Grisham:”Biochimica”, Zanichelli.

Tratto da RH Garrett, CM Grisham:"Biochimica", Zanichelli.


Passaggio da deossi Hb (T) a HbO2 (R)

Il legame con l’O2, quindi coinvolge l’interfaccia tra le subunità, regioni contatto, provocando la rottura dei ponti salini e di ponti H

MODIFICAZIONE CONFORMAZIONALE

Passaggio da deossi Hb (T) a HbO2 (R) (segue)

Le regioni di contatto α2β1 ed α1β2 fungono da interruttore per il passaggio dalla forma T alla forma R.
In seguito all’ossigenazione, la coppia di subunita’ α1β1 ruota di 15 gradi rispetto α2β2

Immagine autoprodotta.

Immagine autoprodotta.


Passaggio da deossi Hb (T) a HbO2 (R) (segue)

Il legame della prima molecola di O2 è energeticamente più sfavorito dal numero di legami da rompere, da cui l’aumento sequenziale dell’affinità per l’O2 (sigmoide).

Le molecole di O2 non si legano all’Hb in modo indipendente l’una dall’altra, ma con un legame di tipo cooperativo positivo.

In tal modo il trasporto di O2 è aumentato di circa due volte rispetto ad un legame non cooperativo.

Il legame di O2 al ferro dei gruppi eme, collegando tra di loro parti lontane della molecola di Hb, induce il passaggio di Hb dalla forma:

T (Tesa) → R (Rilasciata)

Modulatori allosterici di Hb

Oltre l’O2 che funge da modulatore omotropico positivo, Hb ha anche modulatori eterotropici:

  • [H+]
  • eliminazione CO2 metabolica
  • legame del 2,3 bis-fosfoglicerato
Immagine autoprodotta.

Immagine autoprodotta.


Trasporto isoidrico

CO2 nel globulo rosso è trasportata sotto forma di HCO3–.

CO2 nel globulo rosso è trasportata sotto forma di HCO3--.


Modulatori allosterici di Hb

Effetto Bohr
Gli ioni H+ che si dissociano da H2CO3 si legano all’HbO2 e la inducono a liberare O2 che diffonde dagli eritrociti alle cellule

HbO2 + H + ↔ HbH+ + O2

A valori più bassi di pH ( > [H+] ) l’affinità di Hb per O2 diminuisce.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox “I Principi di Biochimica di Lehninger” ed.Zanichelli.

Tratto da: DL Nelson e MM Cox "I Principi di Biochimica di Lehninger" ed.Zanichelli.


Modulatori allosterici di Hb (segue)

Effetto Bohr

  • Per ogni O2 liberato si legano 0.5 eq H+
  • Per assumere H+ alcuni siti di Hb aumentano l’affinità nei confronti di tali ioni
  • Nel passaggio di HbO2 ad Hb il pKa di alcuni gruppi cambia
  • I residui coinvolti sono: His 146 β , His 122α, gruppo α-aminico catene α (pKa tra 6-8)
  • < pH porta ad > grado di protonazione favorendo la formazione di coppie ioniche che stabilizzano la forma Hb

Trasporto di CO2

La CO2 e’ trasportata anche da Hb
Sotto forma di carbammato, per interazione con i gruppi α- aminici non ionizzati, estremità aminoterminale di ciascuna catena globinica:

RNH2 + CO2 ↔ R-NH-COO- + H+

Si generano così H+ che favoriscono l’effetto Bohr.

Si generano interazioni elettrostatiche che diminuiscono l’affinità di Hb per O2, stabilizzando la forma T.

Modulatori allosterici di Hb

2,3 BISFOSFOGLICERATO/ 2,3 BPG

Il 2,3 BPG stabilizza la deossiHb formando legami trasversali tra le catene β, diminuendo l’affinità per O2 di 26 volte.

Si lega alla deossiHb in un rapporto di 1:1.

Nell’HbO2 il 2,3 BPG è rilasciato perché la cavità centrale si restringe.


Modulatori allosterici di Hb (segue)

Nell’emoglobina fetale/HbF il BPG si lega meno saldamente, ciò permette il passaggio di O2 da HbO2 materna a quella fetale.

Ciò è dovuto ad un cambio in posizione H21, Ser al posto di His.

Tratto da: JM Berg, JL Tymoczko, L Stryer “Biochimica”   ed Zanichelli.

Tratto da: JM Berg, JL Tymoczko, L Stryer "Biochimica" ed Zanichelli.


Modulatori allosterici di Hb (segue)

Modulatori allosterici

H+, CO2, 2,3-BPG

Stabilizzano la forma T, agiscono su siti diversi, per cui il loro effetto è ADDITIVO

Equilibrio Hb tra forma T ed R


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