La Polymerase Chain Reaction (PCR) consente di ottenere l’aumento esponenziale di un frammento di DNA bersaglio.
Per amplificare il DNA e’ necessario partire da una miscela composta da:
I primers sono brevi sequenze nucleotidiche complementari agli estremi del frammento di DNA da amplificare.
L’identificazione e l’amplificazione di tratti specifici di DNA richiedono quindi la conoscenza delle sequenze nucleotidiche che fiancheggiano il frammento target.
I primers devono:
I primers rappresentano i fattori d’innesco della reazione di amplificazione.
E’ una DNA polimerasi estratta dal Thermophilus aquaticus batterio termofilo perciò è detta Taq polimerasi.
Ha il vantaggio di essere termostabile, quindi resistente alle temperature di denaturazione del primo step del ciclo di amplificazione.
Tale enzima interviene nella fase di extension e catalizza la reazione di ibridazione dei nucleotidi e l’allungamento dei filamenti di DNA.
L’amplificazione procede in direzione 5′-3′; si possono verificare piccoli errori di lettura.
Da ciò si deduce quanto sia importante ottimizzare tutti i parametri della reazione di amplificazione ed in particolare la scelta dei primers.
La reazione di amplificazione prevede 3 step:
La Temperatura di melting (Tm) e’ la temperatura alla quale il 50% delle molecole di DNA sono denaturate.
I fattori che influenzano la temperatura di melting sono:
Attivazione della Taq Polimerasi, allungamento dei frammenti di DNA. In questa fase si ha la formazione dei long products, ossia di frammenti di DNA delimitati solo dal lato in cui i primers ibridizzano.
A partire dal secondo ciclo di amplificazione si formano gli short product. Il nuovo frammento ha polarità inversa ed i primers si legano nella direzione 5'-3'.
La tecnica PCR è automatizzata per l’uso di apparecchi detti termociclizzatori (Thermocyclers). Ogni ciclo di amplificazione è composto da tre step:
Ciascun ciclo è ripetuto 20 – 30 volte e il processo di amplificazione dura ~ 2 ore.
La temperatura, la durata, ed il numero di cicli variano in base al tipo di esperimento che si intende impostare.
La visualizzazione dei DNA/prodotti di amplificazione avviene mediante elettroforesi su gel di agarosio.
Il gel è contenuto in una cella elettroforetica. Nella cella è presente una soluzione elettrolitica che favorisce il passaggio di corrente elettrica quando è collegata ad un alimentatore.
Il voltaggio è calcolato sulla base della lunghezza del gel (5 V/cm).
Il DNA estratto o i frammenti amplificati (gli acidi nucleici in soluzione hanno carica negativa per la presenza dei gruppi fosfati) migrano dal polo negativo verso il polo positivo con velocità differente in funzione di:
Cella elettroforetica orizzontale. Fonte: eppendorf
Il DNA è visualizzato mediante radiazioni ultraviolette, l’apparecchio di emissione è il trasilluminatore.
In fase di polimerizzazione del gel è aggiunto un agente intercalante le basi azotate (bromuro di etidio).
Il bromuro di etidio reagisce emettendo fluorescenza quando esposto ai raggi UV e consente la visualizzazione delle bande di DNA.
Marker / ladder
Sono frammenti di DNA a concentrazione (marker)/lunghezza (ladder) nota, consentono per analogia di stabilire rispettivamente la concentrazione ed il numero di paia di basi dei frammenti amplificati.
A lato: Immagine di gel di agarosio mediante transilluminatore:
Lane 1: ladder
Lane 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9: frammenti di DNA amplificati
1. Introduzione al corso di Biotecnologie applicate all'ispezione degli alimenti di origine animale
2. Struttura del DNA, estrazione, amplificazione
3. Polymerase chain reaction PCR
5. Evoluzioni della tecnica PCR
6. Introduzione alla proteomica
7. Ricerca di patogeni mediante tecniche biomolecolari Escherichia coli
8. Ricerca di patogeni mediante tecniche biomolecolari Campylobacter
9. Ricerca di virus mediante tecniche biomolecolari: Norovirus
10. Identificazione di specie mediante tecniche biomolecolari
11. O.G.M.