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Tiziana Pepe » 2.Struttura del DNA, estrazione, amplificazione


Acido DesossiriboNucleico (DNA)

Definizione:
Macromolecola a carattere acido con struttura secondaria costituita da una catena a doppia elica con avvolgimento destrogiro e polarità inversa.

Unità strutturale del DNA: nucleotide

Ogni nucleotide è formato da:

  • Un gruppo fosforico (H2PO4-);
  • Uno zucchero pentoso (D-2-Desossiriboso) in forma furanica;
  • Basi pirimidiniche: citosina (C) e timina (T);
  • Basi puriniche: guanina (G) e adenina (A).

Struttura chimica del DNA

Struttura chimica del DNA.
Ridisegnato lacellula.net.

Struttura chimica del DNA. Ridisegnato lacellula.net.


DNA: legami della doppia elica

Le basi azotate presenti nei nucleotidi si appaiano internamente alla doppia elica di DNA formando legami ad idrogeno (H).

L’appaiamento avviene tra basi complementari (purina con pirimidina):

  • Timina e Adenina si legano con due legami H
  • Guanina e Citosina si legano con tre legami H

La percentuale della coppia di basi GC rispetto alla coppia di basi TA può variare dal 26 al 74% del totale delle basi in relazione alla specie.

Legami purinici-pirimidinici dei nucleotidi

Timina e Adenina si legano con due legami idrogeno,  Guanina e Citosina  con tre legami idrogeno. Ridisegnato da IPS

Timina e Adenina si legano con due legami idrogeno, Guanina e Citosina con tre legami idrogeno. Ridisegnato da IPS


DNA

Unità funzionale del DNA è il codone:
sequenza di tre nucleotidi che codifica un singolo aminoacido della proteina.

Per esempio l’aminoacido alanina (Ala) è codificato da: GCC
ma anche da GCA
oppure da GCG
oppure da GCU (se si parte da RNA)

Vi sono quindi 4 possibili codoni che codificano tutti per lo stesso aminoacido.
L’insieme dei codoni codificanti per un’intera proteina costituisce un gene.

Studio del DNA mediante Polimerase Chain Reaction (PCR)

La PCR, o reazione a catena della polimerasi, è una tecnica che consente di ottenere numerose copie di un frammento di DNA bersaglio.

  • Il frammento di DNA può avere dimensioni variabili da 1 a 10 kb (1kb= 1000 coppie di basi);
  • Il numero di copie del frammento del DNA aumenta in maniera esponenziale, infatti raddoppia in ogni ciclo di PCR;
  • In 25-30 cicli si ottengono da 106 a 109 copie di DNA amplificato.

Lo studio avviene mediante:

  1. Fase preliminare: Estrazione e purificazione del DNA;
  2. Applicazione della PCR
    • -denaturazione del DNA estratto
    • - annealing o ibridazione dei primers
    • - extension dei frammmenti di DNA;
  3. Visualizzazione dei prodotti di amplificazione;
  4. Studio delle sequenze o dei profili di restrizione.

Estrazione e purificazione del DNA

Per estrarre il DNA da alimenti la prima operazione da effettuare sul materiale di partenza (carne, pesce, latte e derivati ecc) è: la rottura delle membrane cellulari.

Questa può essere effettuata tramite:
Shock Meccanico (macinazione o omogeneizzazione del campione);
Shock Chimico (utilizzo di soluzioni di alcali forti e tensioattivi);
Shock Termico (trattamenti termici con alte/basse temperature).

Successivamente alla rottura della membrana cellulare, il DNA è purificato mediante denaturazione e separazione delle proteine.

A titolo di esempio:
a) Sospensione del campione in soluzione tamponata;
b) Addizione di proteinasi K;
c) Trattamento con fenolo in proporzione 1:1 rispetto al volume dell’estratto;
d) Addizione di RNAasi;
e) Trattamento con cloroformio/alcool isoamilico (24:1, v/v) in proporzione 1:1 rispetto al volume dell’estratto.

Estrazione e purificazione del DNA (segue)

Le fasi successive possono prevedere, a seconda della matrice:

  • separazione della frazione lipidica
    • Addizione al materiale di pari volume di PEG (polietilenglicole) 20%
    • Centrifugazione a 4°C per 20′
  • concentrazione del DNA
    • Trattamento dell’estratto con etanolo in proporzione 2:1 rispetto al volume dell’estratto
    • Centrifugazione (per ottenere il pellet di DNA).
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