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Tiziana Pepe » 5. Evoluzioni della tecnica PCR


Nested PCR

E’ una variante della tecnica di PCR end-point. Prevede due distinte e successive reazioni di amplificazione:

  1. Nella prima amplificazione si utilizzano primers più esterni al frammento di DNA da amplificare
  2. Nella seconda amplificazione si utilizzano primers che amplificano un frammento interno a quello amplificato nella reazione I.

Se il prodotto di amplificazione fosse aspecifico la seconda PCR non andrebbe a buon fine.

Multiplex PCR

Consiste nell’utilizzo di diverse coppie di primers nella stessa reazione di amplificazione. Pertanto risulterà possibile amplificare più frammenti di DNA nella stessa reazione di amplificazione.

Tale tecnica consente di amplificare nella stessa reazione più frammenti di geni caratteristici per una specie, oppure più frammenti specifici appartenenti a specie diverse.

Esempio di quadro elettroforetico dopo PCR multiplex

Corsa elettroforetica di frammenti di geni che codificano per fattori di patogenicità caratteristici di Escherichia coli O157 H7.

In ogni pozzetto e’ caricato il DNA estratto dei ceppi di E.coli.

In ogni pozzetto e' caricato il DNA estratto dei ceppi di E.coli.


PCR Real Time

Rappresenta un’evoluzione della tecnica di PCR end point, infatti permette mediante visualizzazione la misurazione “in tempo reale” del DNA amplificato.

La maggiore specificità di reazione consente di  ridurre il numero delle repliche effettuate per ciascun campione, necessarie al fine di verificare la ripetibilità delle analisi.

La PCR Real Time consente di abbandonare tutte le manipolazioni successive all’amplificazione, potenziali fonti di inquinamento del campione.

Differenza tra PCR end point e Real time

La PCR End point fornisce solo una stima qualitativa della presenza di frammenti genici nel DNA da analizzare

La PCR Real time permette anche una valutazione quantitativa del DNA presente.

Analisi Real Time
La PCR Real-time può essere effettuata con due differenti chimiche di reazione:

  1. utilizzo di coloranti fluorescenti che si intercalano nella doppia elica del DNA amplificato
  2. utilizzo di sonde fluorescenti specifiche per il tratto di DNA da amplificare

PCR Real time con SYBR Green dye

Il Sybr Green dye è una molecola fluorescente che durante la reazione di PCR Real time si intercala all’interno del doppio filamento di DNA originatosi  ad ogni ciclo di amplificazione.
La miscela di reazione contiene:
- DNA denaturato
- primers
- soluzione tampone
- nucleotidi trifosfati
- Sybr green

Nella fase di denaturazione il Sybr green è libero nella miscela di reazione.
Nella fase di annealing il SYBR Green si posiziona in maniera aspecifica nel solco minore del DNA.
Nella fase di elongation si osserva la  fluorescenza dovuta dalla presenza del Sybr green nella doppia elica degli ampliconi.

La fluorescenza è dovuta al legame del Sybr green all’interno dell’acido nucleico a doppia elica.

REAL TIME PCR con SYBR Green dye

Molecole del colorante Sybr Green nelle tre fasi di PCR.

Molecole del colorante Sybr Green nelle tre fasi di PCR.


Limiti della chimica Sybr green

La molecola del colorante fluorescente si lega indistintamente a tutti i frammenti di acido nucleico a doppia elica.

Quindi per evitare risultati falsi positivi, i parametri di ogni reazione di amplificazione (scelta di primers specifici, concentrazione del campione, ecc.) devono essere ottimizzati.

PCR Real time – Uso di sonde fluorescenti

Le sonde sono sequenze oligonucleotidiche rese fluorescenti da alcuni fluorocromi. Le  sonde più comuni utilizzate nelle reazioni PCR Real time sono:

  • Sonde Scorpion
  • Sonde FRET
    • (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
  • Sonde Dual-labeled
    • (sonde TaqMan)
  • Molecular beacons

Sonda dual-labeled – Meccanismo di ibridazione

La sonda dual-labeled più comune è la sonda TaqMan. Tale sonda ibridizza un tratto di genoma interno al frammento di DNA  amplificato dalla coppia di primers.

All’estremità 5′ della sonda è legato il Reporter, fluorocromo ad alta energia.
All’estremità 3′ è legato il Quencher, fluorocromo a bassa energia.

Quando i fluorocromi sono legati alla sonda, i fotoni emessi dal Reporter sono assorbiti dal Quencher, che ha minore livello energetico.

PCR Real time – Sonda TaqMan

Nellafase di denaturazione non vi è emissione di fluorescenza.

Nellafase di denaturazione non vi è emissione di fluorescenza.


PCR Real time – Sonda TaqMan (segue)

Durante l’annealing, i primers e la sonda si uniscono ai tratti di DNA ad essi complementari. 
Reporter e Quencher sono ancora legati alla sonda.

Durante l'annealing, i primers e la sonda si uniscono ai tratti di DNA ad essi complementari. Reporter e Quencher sono ancora legati alla sonda.


PCR Real time – Sonda TaqMan (segue)

Nella fase di estensione:

  • l’attivazione della Taq e il coseguente appaiamento dei nucleotidi trifosfati  raggiunge la sonda.
  • Il Reporter, all’estremità 5′, si stacca dalla sonda.
  • I fotoni del Reporter non sono più assorbiti dal Quencher ed emettono fluorescenza.
Fase di extension.

Fase di extension.


Real Time PCR – Lettura e analisi dei risultati

Lettura dei risultati:
Quando la sonda emette fluorescenza si ha la conferma in tempo reale dell’amplificazione del tratto di DNA ricercato.
L’esame di Real Time PCR avviene in termociclizzatori in grado di registrare la fluorescenza.
Rispetto alla PCR end-point non c’è più bisogno di analizzare i risultati dell’amplificazione tramite corsa elettroforetica.

Termociclizzatore per PCR Real Time.

Termociclizzatore per PCR Real Time.


Analisi dei risultati:
La fluorescenza emessa in fase di amplificazione è registrata  da software dedicati che visualizzano il segnale di fluorescenza come curve di amplificazione.
Le curve sono riportate su monitor collegati al termociclizzatore.
L’emissione di fluorescenza è direttamente proporzionale alla quantità di DNA presente.
Per elevate concentrazioni di DNA le curve di amplificazione si registrano già dopo i primi cicli di PCR.

Cicli di PCR.

Cicli di PCR.


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