Riconoscimento di specie patogene quali:
Per il controllo delle frodi alimentari
Famiglia: Enterobacteriaceae
Genere: Escherichiae
Specie: coli, blattali, fergusoni, hermani, vulneris, adecarboxylate
Escherichia coli comprende ceppi saprofiti e ceppi patogeni che provocano:
Gli Escherichia si classificano (secondo Padhye e Doyle, 1992) in base a:
I ceppi di E. coli patogeni si differenziano in:
Tra gli E.coli enteroemorragici si distingue il Sottogruppo VTEC. Vengono definiti così in quanto produttori di verocitossine (VT1 e VT2). Le VT provocano effetto citopatico sulle cellule Vero ed HeLa.
All’interno del sottogruppo VTEC si distinguono:
Il capostipite dei VTEC è E. coli O157:H7
Caratteri generali comuni a tutti gli E. coli
Corto batterio bastoncellare Gram -, mobile o immobile. Il sierotipo O157: H7 possiede caratteri biochimici comuni alla specie E. coli.
› ossidasi -
› Voges-Proskauer -
› catalasi +
› indolo +
› rosso metile +
› lattosio fermentante
› aerobio-anaerobio facoltativo
Caratteri distintivi
N.B. esistono alcuni stipiti di O157:H7 sorbitolo fermentanti e b-glucoronidasi +
Fattori di virulenza
Geni produttori di verocitossine indicate come VT1 e VT2.
Le verocitossine possiedono 1 subunità A attiva e 5 subunità B che legano i recettori di membrana (costituiti dal ceramide GB3).
→ Locus LEE (Locus di produzione della proteina Adesina che lega e riduce ad un tappeto cellulare gli enterociti);
→ Plasmide 60 MDa (che codifica per fimbrie ed enteroemolisine);
→ Gene flic (che codifica per l’antigene flagellare);
→ pili di adesione.
Trasmissione dell’infezione all’uomo
Il serbatoio principale è il BOVINO ADULTO sano, accanto a Suini, Avicoli e Ovini. Le vie di trasmissione sono gli alimenti contaminati, ma esiste anche possibilità di trasmissione da persona a persona. Le maggiori fonti di contagio per l’uomo sono:
I fattori che influenzano la proliferazione intestinale di E. coli O157 H7 e la loro escrezione sono:
L’infezione si contrae per os.Il periodo di incubazione è di 4- 8 gg. La sede di colonizzazione del patogeno è il colon. Le modalità di infezione sono dette attaching-effacing. Il meccanismo patogeno avviene mediante la produzione di tossine.La sede d’elezione dell’infezione sono le cellule endoteliali del microcircolo di rene e colon.
Sintomatologia dell’infezione
Le forme più comuni di infezione da E. coli O157H7 sono:
Forma asintomatica → Nessun sintomo;
Colite emorragica → Crampi addominali, diarrea acquosa, diarrea emorragica nausea, vomito, febbre assente o poca elevata;
Sindrome emolitica uremica (HUS)*(triade sintomatologica) → Insufficienza renale acuta, piastrinopenia, anemi emolitica microangiopatica, complicanze al SNC e al miocardio.
Porpora trombociticatrombocitopenica (PTT) → Sintomi simili a HUS con coinvolgimento del SNC, anemia emolitica microangiopatica, grave trombocitopenia, manifestazioni neurologiche variabili, febbre e bassa azotemia ALTA MORTALITA’.
*evoluzione del 5-10% dei casi di colite emorragica, sono colpiti i pazienti immunodepressi, anziani e bambini.
La ricerca viene effettuata su terreno liquido arricchito con sostanze ad attività antibiotica.
I terreni più utilizzati sono:
Un’altra tecnica è l’Immunoseparazione magnetica in cui si utilizzano anticorpi specifici per l’antigene O157 adesi a supporti magnetici.
Oppure si effettua una semina del batterio su terreno solido selettivo differenziale. Si usa:
Interpretazione dei risultati:
Si possono effettuare anche:
Test fluorogeno basato sull’impiego del MUG (4-metilumbelliferil beta-D-glucuronide).
Il substrato fluorogeno (MUG) forma macchie fluorescenti (sotto luce UV) attorno all’E.Coli (batteri produttori di beta-glucoronidasi).
Test cromogeno basato sull’impiego del BCIG (5-Br-4-Cl-3-indolil-_-D-glucuronide).
Il metodo permette di contare il numero delle colonie di E. coli cresciute su una membrana posta su terreno agarizzato addizionato con sostanze cromogene.
Altri test biochimici
→ Sistemi Api 20E (bioMèrieux)
→ Enterotubo (Roche)
→ Microbact 12A (MedVet)
Per l’identificazione dei microrganismi sospetti in base a caratteristiche immunologiche si usano:
Tra i metodi innovativi di ricerca dell’ E.Coli O157H7 vi è:
Identificazione e differenziazione nell’ambito dei VTEC del ceppo O157:H7 attraverso l’uso di sonde oligonucleotidiche (PCR).
Tale metodica presenta:
La PCR multiplex è in grado di evidenziare in un’unica reazione di amplificazione numerosi loci genici.
L’uso della PCR multiplex risulta molto utile per caratterizzare il sierotipo O157:H7 di E. coli, in quanto permette di identificare le espressioni geniche correlate ai suoi fattori di virulenza.
I tratti genomici amplificati per la caratterizzazione di E. coli O157H7 frammenti di geni che codificano per i fattori di virulenza del batterio:
L’estrazione del DNA avviene a partire da colture pure e viene effettuata mediante lisi cellulare per shock termico.
I Primers scelti per la PCR sono:
La fase finale prevede l’analisi dei prodotti dell’amplificazione attraverso corsa elettroforetica su gel di agarosio.
Nell’immagine:
Pozzetti 1, 6: Ladder 100 bp
Pozzetto 2: Ceppo E.coli E32511
Pozzetto 3: Ceppo E.coli E-D 228
Pozzetto 4 : Ceppo E.coli H30
Pozzetto 5: Ceppo E.coli EDL 933
Nelle premesse si legge che:
Il CSMVSP ha emesso il 21 e 22 gennaio 2003 un parere sulla presenza di
E. coli produttori di verocitossine (VTEC) negli alimenti, nel quale reputa
poco probabile che l’applicazione a VTEC O157 di una norma microbiologica per prodotti finali produca una riduzione significativa dei rischi connessi per i consumatori. Tuttavia, la definizione di linee guida microbiologiche intese a ridurre la contaminazione fecale lungo la catena alimentare può contribuire a ridurre i rischi per la salute pubblica,compresi quelli associati ai VTEC. Il CSMVSP ha individuato le seguenti categorie alimentari per le quali i VTEC rappresentano un pericolo per la salute pubblica:
la carne di manzo cruda o poco cotta ed eventualmente la carne di altri ruminanti, la carne macinata, la carne di manzo fermentata e i prodotti derivati, il latte crudo e i prodotti a base di latte crudo, i prodotti freschi, in particolare i semi germogliati e i succhi di frutta e di ortaggi non pastorizzati.
1. Introduzione al corso di Biotecnologie applicate all'ispezione degli alimenti di origine animale
2. Struttura del DNA, estrazione, amplificazione
3. Polymerase chain reaction PCR
5. Evoluzioni della tecnica PCR
6. Introduzione alla proteomica
7. Ricerca di patogeni mediante tecniche biomolecolari Escherichia coli
8. Ricerca di patogeni mediante tecniche biomolecolari Campylobacter
9. Ricerca di virus mediante tecniche biomolecolari: Norovirus
10. Identificazione di specie mediante tecniche biomolecolari
11. O.G.M.