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Tiziana Pepe » 7.Ricerca di patogeni mediante tecniche biomolecolari Escherichia coli


Tecniche di biologia molecolare applicate alla produzione e all’igiene degli alimenti

Riconoscimento di specie patogene quali:

  • Virus
  • Batteri
  • Protozoi
  • Miceti

Per il controllo delle frodi alimentari

  • Sostituzione di specie
  • Omissione di dichiarazione (specie, OGM)

Escherichia coli

Famiglia: Enterobacteriaceae
Genere: Escherichiae
Specie: coli, blattali, fergusoni, hermani, vulneris, adecarboxylate

Escherichia coli comprende ceppi saprofiti e ceppi patogeni che provocano:

  • negli animali
    • mastiti bovine
    • setticemie emorragiche nei suini
  • nell’uomo
    • sindromi uremico
    • emolitiche
    • meningiti
    • setticemie
    • malattie immunologiche
    • artrite reumatoide
    • forme enteriche

Classificazione degli E. coli patogeni

Gli Escherichia si classificano (secondo Padhye e Doyle, 1992) in base a:

  1. virulenza
  2. modalità d’azione sulla mucosa intestinale
  3. epidemiologia e sintomatologia clinica indotta

I ceppi di E. coli patogeni si differenziano in:

  • ETEC – E. coli enterotossigeni (causa della diarrea del viaggiatore);
  • EPEC – E. coli enteropatogeni (diarrea infantile);
  • EIEC – E. coli enteroinvasivi (diarrea acquosa);
  • EHEC – E. coli enteroemorragici (diarrea emorragica).

EHEC

Tra gli E.coli enteroemorragici si distingue il Sottogruppo VTEC. Vengono definiti così in quanto produttori di verocitossine (VT1 e VT2). Le VT provocano effetto citopatico sulle cellule Vero ed HeLa.

All’interno del sottogruppo VTEC si distinguono:

  • E. coli produttori di tossine
    • in traccia
    • a bassi livelli
    • ad alti livelli

Il capostipite dei VTEC è E. coli O157:H7

E. Coli O157:H7

Caratteri generali comuni a tutti gli E. coli

Corto batterio bastoncellare Gram -, mobile o immobile. Il sierotipo O157: H7 possiede caratteri biochimici comuni alla specie E. coli.
› ossidasi -
Voges-Proskauer -
› catalasi +
› indolo +
› rosso metile +
› lattosio fermentante
› aerobio-anaerobio facoltativo

Caratteri distintivi

  • Incapacità a fermentare il sorbitolo (80.3% dei ceppi di E. coli sono sorbitolo fermentanti).
  • Assenza dell’enzima b-glucoronidasi (96.0 % dei ceppi di E. coli sono b- glucoronidasi +)
  • Resistenza termica: da -20°C a +40°C. Possiedono Heat Shock Proteins -HSPs- (pool di proteine)
  • pH di crescita: da 3.5 a 9.0

N.B. esistono alcuni stipiti di O157:H7 sorbitolo fermentanti e b-glucoronidasi +

E. Coli O157:H7 (segue)

Fattori di virulenza
Geni produttori di verocitossine indicate come VT1 e VT2.
Le verocitossine possiedono 1 subunità A attiva e 5 subunità B che legano i recettori di membrana (costituiti dal ceramide GB3).

→ Locus LEE (Locus di produzione della proteina Adesina che lega e riduce ad un tappeto cellulare gli enterociti);
Plasmide 60 MDa (che codifica per fimbrie ed enteroemolisine);
Gene flic (che codifica per l’antigene flagellare);
pili di adesione.

Trasmissione dell’infezione all’uomo
Il serbatoio principale è il BOVINO ADULTO sano, accanto a Suini, Avicoli e Ovini. Le vie di trasmissione sono gli alimenti contaminati, ma esiste anche possibilità di trasmissione da persona a persona. Le maggiori fonti di contagio per l’uomo sono:

  • carne bovina macinata (hamburger);
  • latte non pastorizzato o ricontaminato;
  • verdure;
  • maionese (pH 3,6- 3,9);
  • formaggi;
  • sidro di mele (pH 3,7- 3,9);
  • arrosto di tacchino.

Proliferazione ed escrezione

I fattori che influenzano la proliferazione intestinale di E. coli O157 H7 e la loro escrezione sono:

  • Lo svezzamento;
  • Il cambiamento nella composizione della dieta;
  • Il digiuno;
  • Il trasporto;
  • Le malattie.

Patogenesi e sintomatologia nell’uomo

L’infezione si contrae per os.Il periodo di incubazione è di 4- 8 gg. La sede di colonizzazione del patogeno è il colon. Le modalità di infezione sono dette attaching-effacing. Il meccanismo patogeno avviene mediante la produzione di tossine.La sede d’elezione dell’infezione sono le cellule endoteliali del microcircolo di rene e colon.

Sintomatologia dell’infezione
Le forme più comuni di infezione da E. coli O157H7 sono:

Forma asintomatica → Nessun sintomo;
Colite emorragica → Crampi addominali, diarrea acquosa, diarrea emorragica nausea, vomito, febbre assente o poca elevata;
Sindrome emolitica uremica (HUS)*(triade sintomatologica) → Insufficienza renale acuta, piastrinopenia, anemi emolitica microangiopatica, complicanze al SNC e al miocardio.
Porpora trombociticatrombocitopenica (PTT) → Sintomi simili a HUS con coinvolgimento del SNC, anemia emolitica microangiopatica, grave trombocitopenia, manifestazioni neurologiche variabili, febbre e bassa azotemia ALTA MORTALITA’.

*evoluzione del 5-10% dei casi di colite emorragica, sono colpiti i pazienti immunodepressi, anziani e bambini.

Ricerca di E. coli O157:H7 – Metodi di isolamento e identificazione microbiologica

La ricerca viene effettuata su terreno liquido arricchito con sostanze ad attività antibiotica.

I terreni più utilizzati sono:

  • modified Tryptone Soya Broth -mTSB- con addizione di novobiocina o di acriflavina
  • Bacto@ modified Ec Medium

Un’altra tecnica è l’Immunoseparazione magnetica in cui si utilizzano anticorpi specifici per l’antigene O157 adesi a supporti magnetici.

Oppure si effettua una semina del batterio su terreno solido selettivo differenziale. Si usa:

  • Sorbitol MacConkey agar (SMCA) (sostituzione del lattosio del MCA con D-sorbitolo 0.1%)

Interpretazione dei risultati:

  • colonie sorbitolo – sospette O157:H7
    • (falsi positivi: ceppi di E. coli e altri generi non fermentanti);
  • colonie sorbitolo + con colorazione rosso porpora
    • (falsi negativi: ceppi di O157:H7 sorbitolo fermentanti di cui non è ancora nota la prevalenza).

Ricerca di E. coli O157:H7 – Metodi di isolamento e identificazione microbiologica (segue)

Si possono effettuare anche:

Test fluorogeno basato sull’impiego del MUG (4-metilumbelliferil beta-D-glucuronide).
Il substrato fluorogeno (MUG) forma macchie fluorescenti (sotto luce UV) attorno all’E.Coli (batteri produttori di beta-glucoronidasi).

Test cromogeno basato sull’impiego del BCIG (5-Br-4-Cl-3-indolil-_-D-glucuronide).
Il metodo permette di contare il numero delle colonie di E. coli cresciute su una membrana posta su terreno agarizzato addizionato con sostanze cromogene.

Altri test biochimici
→ Sistemi Api 20E (bioMèrieux)
→ Enterotubo (Roche)
→ Microbact 12A (MedVet)

Per l’identificazione dei microrganismi sospetti in base a caratteristiche immunologiche si usano:

  • Kit di agglutinazione al lattice del sierogruppo O157 (latex test);
  • Specifici antisieri per l’antigene flagellare H7 di E. Coli.

Ricerca di E. coli O157:H7 – Metodi innovativi

Tra i metodi innovativi di ricerca dell’ E.Coli O157H7 vi è:

Identificazione e differenziazione nell’ambito dei VTEC del ceppo O157:H7 attraverso l’uso di sonde oligonucleotidiche (PCR).

Tale metodica presenta:

  • Alta sensibilità
    • possibilità di ritrovamento del patogeno anche a basse concentrazioni;
  • Alta specificità
    • il numero di eventuali falsi positivi è molto limitato;
  • Ampia versatilità
    • possibilità di identificare altri sierotipi VTEC;
  • Rapidità di esecuzione
    • La tradizionale tecnica PCR consente di identificare singoli tratti del genoma;
    • La PCR, applicata dopo coltura di prearricchimento, permette di identificare negli alimenti i ceppi batterici patogeni in 2-4 h.

PCR multiplex

La PCR multiplex è in grado di evidenziare in un’unica reazione di amplificazione numerosi loci genici.

L’uso della PCR multiplex risulta molto utile per caratterizzare il sierotipo O157:H7 di E. coli, in quanto permette di identificare le espressioni geniche correlate ai suoi fattori di virulenza.

I tratti genomici amplificati per la caratterizzazione di E. coli O157H7 frammenti di geni che codificano per i fattori di virulenza del batterio:

  • Regione upstream del gene eaeA (primers SZ) (Meng et al., 1996);
  • Gene eaeA (attaching and effacing) (primers C) (Sandhu et al., 1996);
  • Geni di verocitossine (SLT-I e SLT-II);
  • DNA Plasmidico (50-70 MDa) (Fratamico et al., 1993);
  • Antigene H7 (flagellare) (Gannon et al., 1997).

Ricerca mediante PCR

L’estrazione del DNA avviene a partire da colture pure e viene effettuata mediante lisi cellulare per shock termico.

I Primers scelti per la PCR sono:

  • SLT-1 (210 bp) per VT1 (Meng et al., 1995);
  • SLT-2 (484 bp) per VT2 (Meng et al., 1995);
  • MFS-I (166 bp) per DNA plasmidico (Fratamico et al., 1995);
  • FLICH7 (650 bp) per l’antigene H7 (Gannon et al., 1997).

Elettroforesi

La fase finale prevede l’analisi dei prodotti dell’amplificazione attraverso corsa elettroforetica su gel di agarosio.

Nell’immagine:

Pozzetti 1, 6: Ladder 100 bp
Pozzetto 2: Ceppo E.coli E32511
Pozzetto 3: Ceppo E.coli E-D 228
Pozzetto 4 : Ceppo E.coli H30
Pozzetto 5: Ceppo E.coli EDL 933

Elettroforesi delle colture pure di E.Coli O157H7. A multiplex polymerase chain reaction assay for rapid detection and identification of Escherichia coli O157:H7 in foods and bovine feces. Fratamico PM, Bagi LK, Pepe T. J Food Prot. 2000 Aug;63(8):1032-7

Elettroforesi delle colture pure di E.Coli O157H7. A multiplex polymerase chain reaction assay for rapid detection and identification of Escherichia coli O157:H7 in foods and bovine feces. Fratamico PM, Bagi LK, Pepe T. J Food Prot. 2000 Aug;63(8):1032-7


Riferimenti normativi – Reg. Ce 2073/2005

Nelle premesse si legge che:

Il CSMVSP ha emesso il 21 e 22 gennaio 2003 un parere sulla presenza di
E. coli produttori di verocitossine (VTEC) negli alimenti, nel quale reputa
poco probabile che l’applicazione a VTEC O157 di una norma microbiologica per prodotti finali produca una riduzione significativa dei rischi connessi per i consumatori. Tuttavia, la definizione di linee guida microbiologiche intese a ridurre la contaminazione fecale lungo la catena alimentare può contribuire a ridurre i rischi per la salute pubblica,compresi quelli associati ai VTEC. Il CSMVSP ha individuato le seguenti categorie alimentari per le quali i VTEC rappresentano un pericolo per la salute pubblica:

la carne di manzo cruda o poco cotta ed eventualmente la carne di altri ruminanti, la carne macinata, la carne di manzo fermentata e i prodotti derivati, il latte crudo e i prodotti a base di latte crudo, i prodotti freschi, in particolare i semi germogliati e i succhi di frutta e di ortaggi non pastorizzati.

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