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Tiziana Pepe » 8.Ricerca di patogeni mediante tecniche biomolecolari Campylobacter


Campylobacter spp.

Campylobacter è classificato tra i “patogeni emergenti” in quanto sconosciuto fino a qualche decennio fa.

È stato isolato nella maggioranza dei casi di enterite umana di origine alimentare.

I Campylobacter sono un gruppo di batteri su cui è in corso un’intensa opera di revisione critica delle conoscenze.

Campylobacter è tra i principali patogeni veicolati dagli alimenti è responsabile di patologie gastroenteriche più di Salmonella spp., Shigella spp. ed E. coli O157H7.

ENTER-NET Italia, Sezione nazionale della rete europea di sorveglianza per gli enterobatteri patogeni coordinato dall’ISS, segnala nel 2005 un aumento degli isolamenti da campioni clinici di Campylobacter spp. (78,2 % C. jejuni e 4,1 % a C. coli).

Principali batteri causa 
di patologie alimentari.

Principali batteri causa di patologie alimentari.


Campylobacter

  • Famiglia: Campylobacteriaceae
  • Genere: Campylobacter (inizialmente incluso nel genere Vibrio)

Il genere Campylobacter comprende 15 tra specie e sottospecie; 12 di esse sono responsabili di patologie dell’uomo e degli animali.

Specie di interesse patologico: C. jejuni, C. coli, C. lari, C. upsaliensis, C. mucosalis.

Caratteri generali

  • Microrganismo di piccole dimensioni
    • (lungo 0,5-5 µm e largo 0,2-0,5 µm)
  • Forma bastoncellare, sottile e spiraliforme (a forma di S)
  • Gram negativo
  • Mobile e rapido in quanto dotato di sottili flagelli
  • Vive bene in microareofilia (O2 dal 5 al 10%) o in anaerobiosi
  • Cresce bene a 37°C

(C. jejuni e C. coli rientrano nel sottogruppo dei Campylobacter termofili perchè crescono bene a 42°-43°C).

Fattori di patogenicità

I principali fattori di patogenicità di Campylobacter sono rappresentati dalla mobilità (solo i ceppi mobili sono patogeni), e dalla capacità di sintetizzare alcune proteine come le adesine (che si legano ai recettori specifici degli enterociti), le invasine (permettono di invadere la sottomucosa) e delle potenti citotossine e enterotossine.

Campylobacter patogeni

Le specie coinvolte nell’insorgenza di patologie sono:

  • Campylobacter jejuni (isolato nel 99% dei casi di enteriti umane)
    1. C. jejuni subsp.jejuni (principale agente di enterite umana, nel mondo)
    2. C. jejuni subsp.doylei (provoca gastroenterite, gastrite, setticemia in uomo e animali)
    3. C. jejuni subsp.fetus (agente di aborto in uomo e animali)
  • Campylobacter coli (isolato meno frequentemente)

Meccanismo d’azione

L’infezione da Campylobacter è contratta attraverso l’assunzione per os di alimenti contaminati. Giunto a livello intestinale la morfologia spiraliforme e la presenza dei flagelli gli permettono di muoversi nel muco della parete intestinale.
Aderisce alle cellule epiteliali enteriche probabilmente grazie alle adesine poste sui flagelli. L’adesione alle cellule HeLa è correlata alla virulenza dell’infezione.
Il movimento flagellare e l’adesione favoriscono l’instaurarsi dell’infezione.

I Campylobacter giunti a livello intestinale, invadono le Caco-2 cells tramite le invasine formando dei vacuoli interni (l’internalizzazione forse avviene con meccanismi di endocitosi microtubuli-dipendenti).

L’organismo reagisce all’invasione e alla produzione di enterotossine attivando le cellule della difesa immunitaria.

Biopsie e autopsie hanno evidenziato la formazione di enterite infiammatoria acuta in presenza di C. jejuni, i tessuti coinvolti mostrano edema della lamina propria con infiltrazione di neutrofili, cellule mononucleari e talvolta eosinofili.

Sintomatologia e decorso

Si possono manifestare:

  • Diarrea di intensità variabile (spesso a carattere emorragico)
  • Febbre
  • Dolori addominali
  • Nausea e vomito
  • Mal di testa

Meno frequentemente si instaurano batteriemia, artriti settiche o altre patologie extraintestinali.

Il decesso è raro e riguarda soprattutto le categorie di consumatori a rischio o con patologie intercorrenti.

Epidemiologia e trasmissione

Il principale serbatoio batterico è rappresentato dal tratto intestinale di un’ampia varietà di animali a sangue caldo (bovini, suini, cani, gatti e soprattutto il pollame).

Le carni di pollame se contaminate dal contenuto fecale durante la macellazione e l’eviscerazione costituiscono la principale via di trasmissione di Campylobacter.

Le carcasse di pollo intere e i vari tagli ottenibili rappresentano la più importante fonte di trasmissione del Campylobacter all’uomo.

Carcasse di pollo intere. Fonte: ars-alimentaria

Carcasse di pollo intere. Fonte: ars-alimentaria


Trasmissione di Campylobacter

Rappresentazione schematica delle principali modalità di trasmissione di Campylobacter.Fonti: ars-alimentaria, Cama, Mente critica, Millecase, Ravenna Farmacie, Cuccioli.to, Parrocchiascilla, Zoonosi, Predicazione.

Rappresentazione schematica delle principali modalità di trasmissione di Campylobacter.Fonti: ars-alimentaria, Cama, Mente critica, Millecase, Ravenna Farmacie, Cuccioli.to, Parrocchiascilla, Zoonosi, Predicazione.


Contaminazione delle carni avicole

Contaminazione delle carni avicole. Fonti: Midisegni, Palio italia, Ars alimentaria.

Contaminazione delle carni avicole. Fonti: Midisegni, Palio italia, Ars alimentaria.


Resistenza agli agenti chimici e fisici

I Campylobacter sono rapidamente uccisi dai trattamenti termici di pastorizzazione (non resistono più di 1 minuto a 60°C) e danneggiati dalle basse temperature, anche se una volta congelati sopravvivono per molti mesi a -20°C.

Sono distrutti dall’essiccamento e dall’O2 atmosferico, dal pH compreso tra 5 e 9 e dai comuni disinfettanti (ipocloriti, fenoli, iodofori e composti dell’ammonio quaternario).

Risultano poco resistenti ai raggi UV e ai raggi γ.

Sopravvivono in ambiente con alte concentrazioni di NaCl (carni salate crude).

Antibiotico-resistenza

Si stanno rapidamente diffondendo, tra gli animali, nell’ambiente e nell’uomo ceppi di Campylobacter antibiotico-resistenti.

Tra il 1997 e il 2001 la percentuale di ceppi di Campylobacter resistenti è salita in misura decisiva, soprattutto contro il ciprofloxacin.

Su 180 ceppi di Campylobacter isolati da carni avicole, il 10% è risultato resistente al ciprofloxacin.

Isolamento di Campylobacter: metodica classica

I campioni di alimenti sono collocati, in modo asettico, in provette contenenti Bolton Selective Broth (brodo di arricchimento).

Incubazione (4h 37 °C e 42 °C 24-48h).

Dopo la crescita un’aliquota di 10 μl è prelevata e strisciata su terreno selettivo (Campylobacter blood-free selective medium)

Le piastre sono poste in condizioni di microaereofilia ed incubate a 42 °C per 48 ore.

Caratterizzazione batterica

Prove di riconoscimento del Campylobacter termofilo secondo norma ISO 10272-1:2006(E) *

Questa norma prevede prima l’attuazione di tre prove per la caratterizzazione batterica:

  1. Morfologia e motilità;
  2. Ossidasi e catalasi test;
  3. Idrolisi dell’ippurato.

*Manual for Reporting on Zoonoses, Zoonotic Agents, Antimicrobial Resistance and Food-borne Outbreaks in the framework of Directive 2003/99/EC (www.efsa.europa.eu/zoonoses).

Sierotipizzazione batterica: metodica biomolecolare

Una piccola ansata batterica è sottoposta ad estrazione del DNA mediante l’utilizzo di kit presenti in commercio. La metodica più utilizzata per l’identificazione di specie è la PCR multiplex.

La miscela di amplificazione è composta da:

  • DNA estratto
  • Soluzione tampone
  • dNTPs (nucleotidi trifosfati)
  • Primers specifici
  • Taq DNA polymerase

I prodotti di amplificazione sono separati mediante elettroforesi in gel di agarosio e visualizzati con transilluminatore UV, previa colorazione con bromuro di etidio.

Risultati- Elettroforesi su gel di agarosio applicata a ceppi batterici di C.jejuni e C.coli.

T. Pepe, R. De Dominicis, G. Esposito,  I. Ventrone,  P. M. Fratamico, and M. Cortesi.  Detection of Campylobacter from Poultry Carcass Skin Samples at Slaughter in Southern Italy. Journal of Food Protection, Vol. 72, No. 8, 2009, Pages 1718–1721

T. Pepe, R. De Dominicis, G. Esposito, I. Ventrone, P. M. Fratamico, and M. Cortesi. Detection of Campylobacter from Poultry Carcass Skin Samples at Slaughter in Southern Italy. Journal of Food Protection, Vol. 72, No. 8, 2009, Pages 1718–1721


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