Tiziana Pepe » 8.Ricerca di patogeni mediante tecniche biomolecolari Campylobacter

Campylobacter

• Famiglia: Campylobacteriaceae
• Genere: Campylobacter (inizialmente incluso nel genere Vibrio)

Il genere Campylobacter comprende 15 tra specie e sottospecie; 12 di esse sono responsabili di patologie dell’uomo e degli animali.

Specie di interesse patologico: C. jejuni, C. coli, C. lari, C. upsaliensis, C. mucosalis.

Caratteri generali

• Microrganismo di piccole dimensioni
  • (lungo 0,5-5 µm e largo 0,2-0,5 µm)
• Forma bastoncellare, sottile e spiraliforme (a forma di S)
• Gram negativo
• Mobile e rapido in quanto dotato di sottili flagelli
• Vive bene in microareofilia (O2 dal 5 al 10%) o in anaerobiosi
• Cresce bene a 37°C

(C. jejuni e C. coli rientrano nel sottogruppo dei Campylobacter termofili perchè crescono bene a 42°-43°C).

Fattori di patogenicità

I principali fattori di patogenicità di Campylobacter sono rappresentati dalla mobilità (solo i ceppi mobili sono patogeni), e dalla capacità di sintetizzare alcune proteine come le adesine (che si legano ai recettori specifici degli enterociti), le invasine (permettono di invadere la sottomucosa) e delle potenti citotossine e enterotossine.

Campylobacter patogeni

Le specie coinvolte nell’insorgenza di patologie sono:

• Campylobacter jejuni (isolato nel 99% dei casi di enteriti umane)
  1. C. jejuni subsp.jejuni (principale agente di enterite umana, nel mondo)
  2. C. jejuni subsp.doylei (provoca gastroenterite, gastrite, setticemia in uomo e animali)
  3. C. jejuni subsp.fetus (agente di aborto in uomo e animali)
• Campylobacter coli (isolato meno frequentemente)

Meccanismo d’azione

L’infezione da Campylobacter è contratta attraverso l’assunzione per os di alimenti contaminati. Giunto a livello intestinale la morfologia spiraliforme e la presenza dei flagelli gli permettono di muoversi nel muco della parete intestinale.
Aderisce alle cellule epiteliali enteriche probabilmente grazie alle adesine poste sui flagelli. L’adesione alle cellule HeLa è correlata alla virulenza dell’infezione.
Il movimento flagellare e l’adesione favoriscono l’instaurarsi dell’infezione.

I Campylobacter giunti a livello intestinale, invadono le Caco-2 cells tramite le invasine formando dei vacuoli interni (l’internalizzazione forse avviene con meccanismi di endocitosi microtubuli-dipendenti).

L’organismo reagisce all’invasione e alla produzione di enterotossine attivando le cellule della difesa immunitaria.

Biopsie e autopsie hanno evidenziato la formazione di enterite infiammatoria acuta in presenza di C. jejuni, i tessuti coinvolti mostrano edema della lamina propria con infiltrazione di neutrofili, cellule mononucleari e talvolta eosinofili.

Sintomatologia e decorso

Si possono manifestare:

• Diarrea di intensità variabile (spesso a carattere emorragico)
• Febbre
• Dolori addominali
• Nausea e vomito
• Mal di testa

Meno frequentemente si instaurano batteriemia, artriti settiche o altre patologie extraintestinali.

Il decesso è raro e riguarda soprattutto le categorie di consumatori a rischio o con patologie intercorrenti.

Trasmissione di Campylobacter

Rappresentazione schematica delle principali modalità di trasmissione di Campylobacter.Fonti: ars-alimentaria, Cama, Mente critica, Millecase, Ravenna Farmacie, Cuccioli.to, Parrocchiascilla, Zoonosi, Predicazione.

Contaminazione delle carni avicole

Contaminazione delle carni avicole. Fonti: Midisegni, Palio italia, Ars alimentaria.

Resistenza agli agenti chimici e fisici

I Campylobacter sono rapidamente uccisi dai trattamenti termici di pastorizzazione (non resistono più di 1 minuto a 60°C) e danneggiati dalle basse temperature, anche se una volta congelati sopravvivono per molti mesi a -20°C.

Sono distrutti dall’essiccamento e dall’O₂ atmosferico, dal pH compreso tra 5 e 9 e dai comuni disinfettanti (ipocloriti, fenoli, iodofori e composti dell’ammonio quaternario).

Risultano poco resistenti ai raggi UV e ai raggi γ.

Sopravvivono in ambiente con alte concentrazioni di NaCl (carni salate crude).

Antibiotico-resistenza

Si stanno rapidamente diffondendo, tra gli animali, nell’ambiente e nell’uomo ceppi di Campylobacter antibiotico-resistenti.

Tra il 1997 e il 2001 la percentuale di ceppi di Campylobacter resistenti è salita in misura decisiva, soprattutto contro il ciprofloxacin.

Su 180 ceppi di Campylobacter isolati da carni avicole, il 10% è risultato resistente al ciprofloxacin.

Isolamento di Campylobacter: metodica classica

I campioni di alimenti sono collocati, in modo asettico, in provette contenenti Bolton Selective Broth (brodo di arricchimento).

Incubazione (4h 37 °C e 42 °C 24-48h).

Dopo la crescita un’aliquota di 10 μl è prelevata e strisciata su terreno selettivo (Campylobacter blood-free selective medium)

Le piastre sono poste in condizioni di microaereofilia ed incubate a 42 °C per 48 ore.

Caratterizzazione batterica

Prove di riconoscimento del Campylobacter termofilo secondo norma ISO 10272-1:2006(E) *

Questa norma prevede prima l’attuazione di tre prove per la caratterizzazione batterica:

1. Morfologia e motilità;
2. Ossidasi e catalasi test;
3. Idrolisi dell’ippurato.

*Manual for Reporting on Zoonoses, Zoonotic Agents, Antimicrobial Resistance and Food-borne Outbreaks in the framework of Directive 2003/99/EC (www.efsa.europa.eu/zoonoses).

Sierotipizzazione batterica: metodica biomolecolare

Una piccola ansata batterica è sottoposta ad estrazione del DNA mediante l’utilizzo di kit presenti in commercio. La metodica più utilizzata per l’identificazione di specie è la PCR multiplex.

La miscela di amplificazione è composta da:

• DNA estratto
• Soluzione tampone
• dNTPs (nucleotidi trifosfati)
• Primers specifici
• Taq DNA polymerase

I prodotti di amplificazione sono separati mediante elettroforesi in gel di agarosio e visualizzati con transilluminatore UV, previa colorazione con bromuro di etidio.

Risultati- Elettroforesi su gel di agarosio applicata a ceppi batterici di C.jejuni e C.coli.

T. Pepe, R. De Dominicis, G. Esposito, I. Ventrone, P. M. Fratamico, and M. Cortesi. Detection of Campylobacter from Poultry Carcass Skin Samples at Slaughter in Southern Italy. Journal of Food Protection, Vol. 72, No. 8, 2009, Pages 1718–1721