Tiziana Pepe » 9.Ricerca di virus mediante tecniche biomolecolari: Norovirus

Norovirus – caratteristiche

La famiglia dei Caliciviridae comprende 4 generi:

• Norovirus
• Sapovirus
• Lagovirus
• Vesivirus.

I Norovirus sono Virus a singolo filamento di RNA, privi di involucro esterno e di forma irregolarmente sferica, ad infettività variabile (la dose infettante è generalmente di 10-100 unità virali, sono eliminati in grande quantità con le feci (108-1010/g feci).

Epidemiologia dei Norovirus

Sono considerati una delle principali cause di gastroenteriti in Europa e nel mondo industrializzato:

Regno Unito: il 15,7 % di tutte le infezioni legate al consumo di vegetali e frutta sono causate dalla contaminazione da Norovirus.

Danimarca: (estate 2005) sono stati notificati più di 1100 casi gastroenterici causate dal consumo di una fornitura di lamponi contaminati con genotipi diversi di Norovirus.

Svezia: (2006) si sono verificati vari episodi tra i quali:

• 15 persone manifestarono sintomi di gastroenterite dopo consumo, in una festa privata, di un dolce a base di crema e lamponi.  Gli esami effettuati sui campioni di feci dei pazienti evidenziarono la presenza di Norovirus;
• 10 persone manifestarono sintomatologia riferibile a Norovirus dopo consumo di un cheesecake con lamponi. La segnalazione tardiva della tossinfezione non consentì il prelievo di campioni di feci, ma durante le indagini emerse che i lamponi utilizzati per il cheesecake erano della stessa marca di quelli trovati nell’episodio precedente.

Epidemiologia dei Norovirus (segue)

Il Sistema di Allerta comunitario ha inoltre registrato nel 2006:

in Danimarca: 2 epidemie collegate al consumo di ostriche (coinvolte 46 persone in un party). Le ostriche provenivano da UK e Francia.

in Olanda: epidemia collegata al consumo di ostriche contaminate da Norovirus. Le ostriche provenivano dalla Francia.

Uno studio condotto in Italia ha evidenziato la presenza di Norovirus in campioni di mitili rilevando che l’assunzione di molluschi crudi rappresenta, nel sud della nostra nazione, il principale fattore di rischio.

Gastroenteriti da Norovirus durante le crociere

I Norovirus sono stati responsabili di epidemie gastroenteriche anche durante crociere:

Luglio – Novembre 2002
due epidemie a bordo di navi da crociera della stessa compagnia.

Ottobre 2003
epidemia a bordo di una nave da crociera nel Mediterraneo.

Gennaio 2005
epidemia a bordo di una nave da crociera nei Caraibi;
epidemia a bordo di una nave da crociera in Florida.

La causa del manifestarsi così frequente di tali patologie durante le crociere è legata al fatto che i focolai epidemici vengono individuati e denunciati più rapidamente rispetto a quanto avvenga sulla terraferma.
La vicinanza degli alloggi in nave potrebbe accrescere le occasioni di contatto.

Gastroenterite da Norovirus: Cenni clinici

Periodo di incubazione: 1-3 giorni

Sintomi: febbre, vomito, diarrea e nausea.
Nei bambini i sintomi sono più lievi, a differenza delle altre gastroenteriti virali.

La malattia ha decorso acuto ed è considerata autolimitante, infatti di solito la guarigione avviene spontaneamente entro 2-3 giorni senza bisogno di ricovero.

Modalita’ di trasmissione dell’infezione

Le vie di diffusione dell’infezione sono varie:

• Oro-fecale
• Aerosol

Le potenziali fonti di contaminazione da Norovirus sono:

• Soggetti infetti portatori
• Escrezioni di animali infetti, roditori, insetti
• Acqua contaminata
• Assunzione di molluschi e vegetali

La fonte di contaminazione principale è rappresentata sempre dagli alimenti.

Controllo dei Norovirus

Le caratteristiche biologiche, fisico-chimiche ed epidemiologiche dei Norovirus ne rendono difficile il controllo.

Il virus è resistente al congelamento e al calore a 60°, alle soluzioni clorinate, al pH di 2.7, ai trattamenti con etere, etanolo o detergenti.

La cottura a vapore o la pulizia dei crostacei non è quindi sufficiente ad eliminare il rischio di infezione virale.

La decontaminazione delle superfici può essere ottenuta con soluzioni contenenti ipoclorito concentrato 5000ppm.

Le misure preventive principali sono la decontaminazione ambientale e la prevenzione della contaminazione di acqua e cibo e, se possibile, isolamento di tutti i soggetti infetti.

Alimenti veicolo di Norovirus

Gli alimenti maggiormente coinvolti nelle infezioni virali sono:

• Vegetali
• Molluschi bivalvi

in entrambi i casi il veicolo dell’infezione da Norovirus è rappresentato dall’acqua contaminata.

Contaminazione primaria e secondaria

Contaminazione primaria

I virus possono venire a contatto con gli alimenti nelle prime fasi di produzione tramite:

• Contaminazione di molluschi bivalvi durante l’accrescimento se allevati in acque non idonee (Reg.CE 854/2004);
• Impiego di acque reflue o inquinate per l’allevamento di molluschi bivalvi (Reg.CE 854/2004);
• Contaminazione di vegetali durante l’irrigazione o la fertilizzazione;
• Contaminazione di vegetali attraverso le radici.

Contaminazione secondaria

La contaminazione virale può verificarsi anche nelle fasi successive di produzione, ossia durante la lavorazione e la distribuzione dell’alimento:

• Operatori che non rispettano le norme igieniche;
• Superfici di lavoro e lavelli contaminati;
• Utensili e attrezzature contaminati (taglieri, strofinacci, spugne abrasive, tovaglie);
• Acqua contaminata utilizzata per la preparazione o il lavaggio degli utensili;
• Contatto con altri alimenti già contaminati.

Molluschi bivalvi come veicolo di malattia

I molluschi bivalvi sono scavatori sessili o sedimentari, che si nutrono di piccole particelle alimentari presenti nelle acque o nei sedimenti, mediante un meccanismo di filtrazione.

Attraverso l’attivo meccanismo di filtrazione accumulano anche particelle batteriche e virali eventualmente presenti nelle acque.

Rappresentano un veicolo di malattia per l’uomo in quanto sono alimenti consumati di frequente per i loro importanti apporti nutrizionali.

Ricerca di virus da matrici alimentari

La ricerca di virus può essere effettuata tramite:

• Microscopia elettronica;
• Saggi immunoenzimatici (ELISA);
• Colture cellulari (i virus risultano spesso difficili da coltivare).

La tecnica biomolecolare è quella di elezione poiché ha una maggiore sensibilità, specificità, rapidità di esecuzione e può essere applicata anche su matrici alimentari complesse.

In particolare si utilizza la Real Time PCR per la determinazione di Norovirus.

Per la ricerca di Norovirus da matrice alimentare si distinguono quattro fasi:

1. Estrazione e concentrazione del virus dalla matrice alimentare
2. Estrazione e purificazione dell’RNA per rimuovere gli inibenti
3. Retrotrascrizione a cDNA tramite l’enzima trascrittasi inversa
4. Amplificazione con RT-PCR

Norovirus : PCR real-time

La PCR real-time permette di quantificare i prodotti di amplificazione grazie ad un sistema basato sulla rilevazione della fluorescenza.

Per la ricerca di Norovirus in molluschi bivalvi si utilizza la chimica TaqMan.

Amplificazione dei Norovirus

In PCR Real Time si amplifica un frammento di genoma compreso tra ORF 1 e ORF 2 in quanto presenta minori mutazioni intraspecie. Ridisegnato da Virus sequence database.

Regolamento (CE) 2073/2005

Criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari.

I criteri microbiologici devono specificare il numero delle unità campionarie da prelevare, il metodo analitico e il numero delle unità campionarie che dovrebbero essere conformi al limite.
I criteri microbiologici indicano come orientarsi per l’accettabilità di un prodotto e dei relativi processi di lavorazione, manipolazione e distribuzione, in base all’assenza, alla presenza o al numero di microrganismi e/o in base alla quantità delle relative tossine/metaboliti.
Revisione dei criteri microbiologici in base all’evoluzione e ai progressi scientifici, tecnologici e metodologici nel settore.

Nei consideranda iniziali si legge che:

• …gli indicatori fecali non sono affidabili per dimostrare la presenza o assenza di NLV. Punto 12
• ….non è una pratica sicura basarsi sulla rimozione degli indicatori batterici per determinare i tempi di depurazione dei frutti di mare. Punto 12
• In particolare, è opportuno che i criteri per i virus patogeni nei molluschi bivalvi vivi siano fissati quando i metodi d’analisi sono stati sufficientemente messi a punto. Punto 23
• Si ribadisce la necessità dello sviluppo di metodi di analisi per virus enterici e per altri rischi microbiologici. Punto 27