Ulteriori applicazioni di biologia molecolare:
Evoluzioni della tecnica PCR:
RFLP: acronimo di Restriction Fragment Length Polymorphism
Consiste nell’ analisi dei polimorfismi di lunghezza di frammenti del DNA ottenuti per digestione con enzimi di restrizione.
Tale tecnica è utilizzata, ad esempio, per il riconoscimento di specie.
In natura sono prodotti da batteri ed utilizzati dalla cellula batterica per difendersi dall’invasione di DNA estranei, per lo più di origine virale.
Gli enzimi di restrizione permettono di frammentare il genoma in punti precisi e, soprattutto, in maniera riproducibile.
Il DNA estratto e purificato può essere digerito con enzimi di restrizione di sintesi (endonucleasi) che tagliano in punti specifici le sequenze nucleotidiche.
I frammenti così ottenuti sono separati mediante elettroforesi su gel di agarosio.
Lo studio dei pattern di restrizione consente il riconoscimento di specie.
E’ una tecnica che consente di ottenere la massima informazione su una molecola di DNA determinandone la sequenza nucleotidica completa.
Determinare la sequenza di una specifica regione di DNA è indispensabile per la messa in atto di qualsiasi procedura atta alla manipolazione del DNA.
Sequenziare un frammento di DNA specie-specifico consente di riconoscere la specie di provenienza a partire da alimenti di origine animale.
Per effettuare il sequenziamento di un frammento amplificato di DNA è necessario allontanare eventuali residui di proteine, RNA, frammenti cellulari, ecc. tramite:
Successivamente si effettua:
La PCR di sequenza consiste nella ri-amplificazione del frammento di DNA utilizzando:
Sono nucleotidi privi del gruppo ossidrile (-OH) all’estremità 3′ del desossiribosio.
Tale mancanza impedisce il legame tra i nucleotidi e blocca l’allungamento del filamento di acido nucleico.
I nucleotidi terminator sono marcati con fluorocromi differenti (adenina-terminator, guanina-terminator, citosina-terminator, timina-terminator).
Il sequenziatore sottopone il prodotto della PCR di sequenziamento ad elettroforesi all’interno di un capillare.
Un raggio laser colpisce il capillare eccitando la fluorescenza dei fluorocromi.
Ciascuno dei quattro fluorocromi (un fluorocromo diverso per ogni base azotata) emette fluorescenza con diversa lunghezza d’onda.
Una cellula fotoelettrica all’interno del sequenziatore rileva il tipo e l’intensità luminosa emessa dai fluorocromi eccitati dal laser. La fluorescenza è registrata in forma grafica come picchi.
La sequenza dei picchi corrisponde alla sequenza dei nucleotidi.
Il colore del picco corrisponde al tipo di base azotata (l’intensità o altezza del picco invece è irrilevante).
La sequenza ottenuta viene inserita in GenBank, una banca dati pubblica contenente circa 50 milioni di sequenze geniche di tutti gli organismi viventi e analizzata attraverso software dedicati (Blast, Bioedit, ecc.).
Il motore di ricerca individua le sequenze presenti in database che hanno il più elevato grado di omologia con la sequenza in esame.
1. Introduzione al corso di Biotecnologie applicate all'ispezione degli alimenti di origine animale
2. Struttura del DNA, estrazione, amplificazione
3. Polymerase chain reaction PCR
5. Evoluzioni della tecnica PCR
6. Introduzione alla proteomica
7. Ricerca di patogeni mediante tecniche biomolecolari Escherichia coli
8. Ricerca di patogeni mediante tecniche biomolecolari Campylobacter
9. Ricerca di virus mediante tecniche biomolecolari: Norovirus
10. Identificazione di specie mediante tecniche biomolecolari
11. O.G.M.
Corsa elettroforetica di frammenti di restrizione specie-specifici di alcune specie ittiche.