Laura Manna » 7.Metodi di diagnosi convenzionali ed innovativi in corso di Leishmaniosi

Leishmaniosi - diagnosi di laboratorio

La diagnosi di Leishmaniosi si effettua mediante:

1. Ricerca della Leishmania;
2. La determinazione del titolo anticorpale;
3. Elettroforesi delle sieroproteine e proteine totali.

Esami diretti

Esame microscopico.

Esame Polymerase Chain Reaction (PCR e RT-PCR).

Esame Microscopico

• Linfonodi
• Midollo osseo

VANTAGGI: semplice, economico, rapido, specifico.
SVANTAGGI: bassa sensibilità, difficoltà nel campionamento (midollo).

Un esame microscopico negativo NON esclude la diagnosi di leishmaniosi.

PCR: Reazione a Catena della Polimerasi

La PCR (Polymerase Chain Reaction) consiste nella sintesi ciclica di DNA in vitro mediante l’uso di oligonucleotidi specifici (primers), dell’enzima DNA polimerasi termostabile e del DNA bersaglio viene sottoposta alla reazione.

Mediante cicli successivi di amplificazione avviene la duplicazione di ogni molecola di DNA bersaglio presente nel campione.

PCR: “Gold Standard”?

• Sangue intero
• Linfonodi

VANTAGGI: sensibilità, specificità.
SVANTAGGI: costi.

Al momento non può essere ancora considerato esame di routine per le difficoltà pre-analitiche.

Il titolo anticorpale: IFI

La sierologia consente di determinare anticorpi specifici nei confronti del parassita.

La metodica in immunofluorescenza IFI è ancora oggi ritenuta il “Golden Standard” nella diagnosi della leishmaniosi canina.

Altre metodiche anticorpali

Nessun test commerciale è attualmente paragonabile all’IFI per sensibilità e specificità.

Sensibilità e specificità variabili ne sconsigliano l’uso negli studi epidemiologici, nella pratica clinica, nel follow-up.

Un test negativo o positivo NON esclude o include la diagnosi di leishmaniosi.

Leishmaniosi e P.T. con elettroforesi delle sieroproteine

Proteine totali sieriche P.T. al di sopra dell’intervallo di riferimento.

Aumento delle frazioni beta-1, beta-2 e gammaglobuline, ponti beta-gamma.

Inversione rapporto albumine/globuline.

Diagnosi

Gli esami di laboratorio (profili ematologici e biochimici, profilo delle urine completo: chimico-fisico, rapporto PU/CU) consentono di stadiare il paziente.

Esame delle urine

• Il solo esame chimico-fisico delle urine non permette di stabilire se il cane è proteinurico;

• Il solo rapporto Proteine Urinarie/ Creatinina Urinaria PU/CU non permette di stabilire se il cane è sicuramente proteinurico;

• L’unico esame che attualmente permette lo studio della proteinuria nel cane è la elettroforesi modificata per peso molecolare su Sodio Dodecil Solfato Agar Gel SDS-Age.

Leishmaniosi - diagnosi di laboratorio

Mediante la valutazione della proteinuria nel cane è un importante ausilio diagnostico soprattutto nei cani senza apparenti segni clinici di Leishmaniosi ma positivi ai test di ricerca del protozoo e/o anticorpali.

La real time PCR sulle urine rappresenta un test predittivo per la valutazione della funzionalità renale consente di avere più dati nell’iter clinico che porta alla decisione sempre critica del trattamento o meno dei soggetti asintomatici o paucisintomatici.

Leishmaniosi - diagnosi di laboratorio

Attualmente la diagnosi di leishmaniosi in presenza di sintomi clinici non rappresenta un problema.
Sierologia-PCR.
Importanza dei cani asintomatici in una zona endemica è legata alla presenza di cani con sierologia border-line nei quali sono necessari test biomolecolari per stabilire la presenza e la quantità di leishmania nei tessuti, in particolare nella cute, che rappresenta il serbatoio ed il primo sito di contatto del flebotomo.

Killick-Kendrick R. and Killick-Kendrick M.1999 Proceeding of the International canine leishmaniasis forum. Spain.

Leishmaniosi - diagnosi di laboratorio

asintomatici
↓
IFI- o basso titolo
Cross-reazione
o artefatti
↓
PCR-
Coltura
↓
animali sani

Leishmaniosi - diagnosi di laboratorio

Asintomatici → PCR+

• IFI +
• Disordini biochimici
• Forma criptica
• o prelatenti
• IFI titoli bassi
• titoli alti
• malattia Th2
• TNF – IL4 – IL10
• Resistenza? TH1
• INF g
• IL2

Leishmaniosi - diagnosi di laboratorio

20 cani PCR+ IFI+
5 asintomatici → Non infettano i flebotomi
7 oligosintomatici → 2 su 7 infettano
8 sintomatici → 4 su 8 infettano

1. La presenza dei sintomi è legata alla quota infettante
2. Un abbassamento della quota parassitaria mediante terapia a lungo termine riduce la possibilità di reservoir. Di cui si riduce la bassa pericolosità di cani trattati.

Canine Visceral Leishmaniasis in colombia:
Relationship between clinical and parassitologic status and infectivity
For sand flies Travi B et al Am. Journal Trop Med. Hyg. 2003

Terapia farmacologica a lungo termine

Antimoniali + Allopurinolo
Miltefosine+Allopurinolo