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Laura Manna » 7.Metodi di diagnosi convenzionali ed innovativi in corso di Leishmaniosi


Leishmaniosi - diagnosi di laboratorio

La diagnosi di Leishmaniosi si effettua mediante:

  1. Ricerca della Leishmania;
  2. La determinazione del titolo anticorpale;
  3. Elettroforesi delle sieroproteine e proteine totali.

Esami diretti

Esame microscopico.

Esame Polymerase Chain Reaction (PCR e RT-PCR).

Esame Microscopico

  • Linfonodi
  • Midollo osseo

VANTAGGI: semplice, economico, rapido, specifico.
SVANTAGGI: bassa sensibilità, difficoltà nel campionamento (midollo).

Un esame microscopico negativo NON esclude la diagnosi di leishmaniosi.

PCR: Reazione a Catena della Polimerasi

La PCR (Polymerase Chain Reaction) consiste nella sintesi ciclica di DNA in vitro mediante l’uso di oligonucleotidi specifici (primers), dell’enzima DNA polimerasi termostabile e del DNA bersaglio viene sottoposta alla reazione.

Mediante cicli successivi di amplificazione avviene la duplicazione di ogni molecola di DNA bersaglio presente nel campione.

PCR: “Gold Standard”?

  • Sangue intero
  • Linfonodi

VANTAGGI: sensibilità, specificità.
SVANTAGGI: costi.

Al momento non può essere ancora considerato esame di routine per le difficoltà pre-analitiche.

Il titolo anticorpale: IFI

La sierologia consente di determinare anticorpi specifici nei confronti del parassita.

La metodica in immunofluorescenza IFI è ancora oggi ritenuta il “Golden Standard” nella diagnosi della leishmaniosi canina.

Altre metodiche anticorpali

Nessun test commerciale è attualmente paragonabile all’IFI per sensibilità e specificità.

Sensibilità e specificità variabili ne sconsigliano l’uso negli studi epidemiologici, nella pratica clinica, nel follow-up.

Un test negativo o positivo NON esclude o include la diagnosi di leishmaniosi.

Leishmaniosi e P.T. con elettroforesi delle sieroproteine

Proteine totali sieriche P.T. al di sopra dell’intervallo di riferimento.

Aumento delle frazioni beta-1, beta-2 e gammaglobuline, ponti beta-gamma.

Inversione rapporto albumine/globuline.

Diagnosi

Gli esami di laboratorio (profili ematologici e biochimici, profilo delle urine completo: chimico-fisico, rapporto PU/CU) consentono di stadiare il paziente.

Esame delle urine

  • Il solo esame chimico-fisico delle urine non permette di stabilire se il cane è proteinurico;
  • Il solo rapporto Proteine Urinarie/ Creatinina Urinaria PU/CU non permette di stabilire se il cane è sicuramente proteinurico;
  • L’unico esame che attualmente permette lo studio della proteinuria nel cane è la elettroforesi modificata per peso molecolare su Sodio Dodecil Solfato Agar Gel SDS-Age.

Leishmaniosi - diagnosi di laboratorio

Mediante la valutazione della proteinuria nel cane è un importante ausilio diagnostico soprattutto nei cani senza apparenti segni clinici di Leishmaniosi ma positivi ai test di ricerca del protozoo e/o anticorpali.

La real time PCR sulle urine rappresenta un test predittivo per la valutazione della funzionalità renale consente di avere più dati nell’iter clinico che porta alla decisione sempre critica del trattamento o meno dei soggetti asintomatici o paucisintomatici.

Leishmaniosi - diagnosi di laboratorio

Sintomatici (oligosintomatici)


PCR+

IFI≥ 1:40

malattia


Leishmaniosi - diagnosi di laboratorio

Attualmente la diagnosi di leishmaniosi in presenza di sintomi clinici non rappresenta un problema.
Sierologia-PCR.
Importanza dei cani asintomatici in una zona endemica è legata alla presenza di cani con sierologia border-line nei quali sono necessari test biomolecolari per stabilire la presenza e la quantità di leishmania nei tessuti, in particolare nella cute, che rappresenta il serbatoio ed il primo sito di contatto del flebotomo.

Killick-Kendrick R. and Killick-Kendrick M.1999 Proceeding of the International canine leishmaniasis forum. Spain.

Leishmaniosi - diagnosi di laboratorio

asintomatici

IFI- o basso titolo
Cross-reazione
o artefatti

PCR-
Coltura

animali sani

Leishmaniosi - diagnosi di laboratorio

Asintomatici → PCR+

  • IFI +
  • Disordini biochimici
  • Forma criptica
  • o prelatenti
  • IFI titoli bassi
  • titoli alti
  • malattia Th2
  • TNF – IL4 – IL10
  • Resistenza? TH1
  • INF g
  • IL2

Leishmaniosi - diagnosi di laboratorio

20 cani PCR+ IFI+
5 asintomatici → Non infettano i flebotomi
7 oligosintomatici → 2 su 7 infettano
8 sintomatici → 4 su 8 infettano

  1. La presenza dei sintomi è legata alla quota infettante
  2. Un abbassamento della quota parassitaria mediante terapia a lungo termine riduce la possibilità di reservoir. Di cui si riduce la bassa pericolosità di cani trattati.

Canine Visceral Leishmaniasis in colombia:
Relationship between clinical and parassitologic status and infectivity
For sand flies Travi B et al Am. Journal Trop Med. Hyg. 2003

Terapia farmacologica a lungo termine

Antimoniali + Allopurinolo
Miltefosine+Allopurinolo

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