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Paola Maiolino » 2.Tecniche di prelievo, fissazione, inclusione e colorazione dei preparati patologici


Tecniche di prelievo

Quando e perché richiedere un esame istologico

  • In tutti i casi in cui è necessario accertare e/o documentare il sospetto “clinico” di una malattia.
  • Quando la diagnosi è indicativa di una “neoplasia”.
  • Quando è necessaria la diagnosi certa per eseguire un idoneo trattamento terapeutico.
  • Quando in sede di esame necroscopico o durante lamacellazione ci si trova davanti ad una lesione non riconoscibile o di natura incerta.

In che cosa consiste l’esame istologico?

Consiste nel prelevare un pezzetto di tessuto dall’organo sede della patologia (biopsia).

Come eseguire il prelievo istologico

Le tecniche variano in base:

  • alla localizzazione anatomica;
  • al tipo di lesione.

Tecniche di prelievo

Le biopsie possono essere grandi o piccole (frustoli).

Le BIOPSIE GRANDI, vengono eseguite in sala settoria (prelievi autoptici) o dopo interventi chirurgici estesi.

Le BIOPSIE PICCOLE, vengono eseguite in sede ambulatoriale e possono essere di cinque tipi:

  1. Biopsia escissionale
  2. Biopsia incisionale
  3. Biopsia per raschiamento
  4. Biopsia con punch
  5. Ago biopsia (ecoguidata)

1° – Biopsia escissionale

Consiste nell’asportare la lesione in toto.

L’asportazione deve essere eseguita in maniera tale che la biopsia contenga sia il tessuto centrale “sede della lesione” sia quello periferico “sano”.

Foto di M.P. Pasolini

Foto di M.P. Pasolini


Tecniche di prelievo

  • Nei casi sospetti di neoplasia, è importante eseguire un’asportazione “ad ampi margini” della lesione onde evitare recidive e/o la progressione neoplastica.
  • Per delimitare l’area tessutale da dover asportare si possono apporre alcuni punti di sutura oppure disegnare i margini con l’inchiostro di china.

2° – Biopsia incisionale

Consiste nell’asportare la lesione “parzialmente”.

L’asportazione deve essere eseguita in maniera tale che il frammento bioptico contenga sia il tessuto “sede della lesione” che quello periferico “sano”.

Questo tipo di biopsia è usata solo a scopo diagnostico ed in diversi casi necessita di un secondo intervento che comporta “l’escissione in toto” della lesione.

Foto di M.P. Pasolini

Foto di M.P. Pasolini


Tecniche di prelievo

Biopsie escissionale ed incisionale

Biopsie escissionale ed incisionale


3° – Raschiamento

Consiste nella raccolta tramite raschiamento di frammenti di tessuto.

Questo tipo di prelievo è usato solo a scopo diagnostico e in larga misura nella patologia genitale femminile, in quella delle vie urinarie,nelle lesioni cutanee superficiali.


4° – Punch biopsia

Consiste nel prelevare un frammento di tessuto di pochi millimetri simile ad una “carotina” mediante un apposito strumento perforatore.

E’ molto usato in dermatologia.


4° – Punch biopsia


5° – Agobiopsia (può essere ecoguidata o no)

E’ simile alla biopsia per punch, ma il prelievo può essere effettuato anche negli organi interni (tiroide, fegato, prostata,ecc.) eseguendo contemporaneamente un’endoscopia e/o un’ecografia.


Tecniche di prelievo

Ago tru-cut. Foto di M.P. Pasolini

Ago tru-cut. Foto di M.P. Pasolini


Fissazione

Conservazione del materiale prelevato

E’ fondamentale per la corretta lettura di un preparato istologico.

Nella maggior parte dei casi il materiale prelevato viene “fissato” cioè viene immerso il più rapidamente possibile in una soluzione acquosa di formalina al 10% tamponata (PH 7).

Il fissativo ha lo scopo di conservare i tessuti, bloccando i fenomeni di autolisi senza però alterarne la morfologia.

I campioni così fissati possono essere sottoposti a tutte le colorazioni istologiche, alla maggior parte delle reazioni istochimiche, immunoistochimiche e, anche alle procedure ultrastrutturali.

Perché la formalina?

  • Preserva la morfologia delle cellule e dei tessuti evitando la distruzione dei determinanti antigenici cioè non modifica in maniera determinante la struttura proteica.
  • Ha un buon potere di penetrazione.

Fissazione

Prima di fissarlo è necessario che il campione prelevato venga sezionato in più parti.


Fissazione

Per la fissazione e la conservazione del campione è necessario utilizzare dei contenitori a “bocca larga” e capienti.

Da evitare

Da evitare


Il rapporto tra formalina e tessuto deve essere di 20:1


Fissazione

I contenitori devono essere etichettati e accompagnati dalla scheda informativa dove sarà riportata la specie, la razza, l’età dell’animale, la sede e la data del prelievo, il nome del medico veterinario inviante e del proprietario.


Inclusione

Generalmente la fissazione è considerata completa dopo 24 ore, trascorse le quali il pezzo può essere avviato alle successive procedure istologiche, oppure conservato come tale in formalina per un tempo indefinito.

N.B. La processazione completa richiede circa tre giorni, alcuni tessuti come l’osso richiedono tempi maggiori.


Inclusione

Il campione una volta fissato viene ridotto in piccoli pezzi.

Posto in apposite gabbiette di plastica che hanno lo scopo di contenerlo nel corso delle fasi successive.


Inclusione

Sciacquato in acqua per un paio d’ore ed infine posto nella IstoKinette dove viene disidratato mediante passaggi attraverso una serie di alcoli a concentrazioni crescenti, fino all’alcool assoluto. Successivamente “chiarificato” in xilolo e poi immerso in paraffina liquida.

Non appena il processo è completo il campione viene trasferito in uno stampo riempito con paraffina fusa, si lascia raffreddare e si ottengono così dei blocchetti di paraffina contenenti il campione di tessuto da analizzare.


Taglio

Il blocchetto viene fissato al microtomo e tagliato in modo da ottenere delle sezioni di 4-6 μm di spessore. Ogni sezione è in continuità con quella precedente: in modo da ottenere un nastro continuo.


Taglio

Le sezioni vengono distese su una piastra o sulla superficie dell’acqua riscaldata (37°) di un bagnomaria, raccolte su un vetrino portaoggetti e lasciate per 12 ore in stufa a 37°C.


Colorazione

I vetrini vengono poi immersi in xilolo (rimuove la paraffina penetrata), reidratati e colorati con ematossilina-eosina, il metodo di colorazione utilizzato “routinariamente” nella maggior parte dei laboratori di diagnostica istopatologica.

Il campione viene poi disidratato, chiarificato e coperto con un vetrino coprioggetto.

Colorazione manuale

Colorazione manuale

Coloratrice automatica

Coloratrice automatica


Colorazione

L’ematossilina è un colorante basico ed ha una forte affinità per gli acidi nucleici, mentre l’eosina, che è un colorante acido, ha una forte affinità per le componenti citoplasmatiche.


Colorazione

Oltre all’ E-E, l’istologo ha a sua disposizione numerosi altri metodi di colorazione.

Alcuni sono specifici in quanto servono per mettere in evidenza alcune componenti tessutali.

Periodic Acid-Shiff” per i
mucopolisaccaridi acidi e neutri

Periodic Acid-Shiff” per i mucopolisaccaridi acidi e neutri

Van Gieson” per il tessuto connettivo e il tessuto muscolare

Van Gieson” per il tessuto connettivo e il tessuto muscolare


Colorazione

Tecniche speciali sono le tecniche istochimiche, istoenzimatiche e immunoistochimiche che rendono possibile la localizzazione di specifici lipidi, carboidrati e proteine presenti nei tessuti.

ATP-ase- fibre 1 (chiare); fibre 2 (Scure)

ATP-ase- fibre 1 (chiare); fibre 2 (Scure)

Distrofina Immunolocalizzazione

Distrofina Immunolocalizzazione


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