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Natascia Cocchia » 11.Gestione del materiale seminale


Gestione materiale seminale

Al momento della raccolta il materiale seminale potrà essere impiegato fresco o potrà
lo sperma può essere conservato per brevi periodi di tempo mediante refrigerazione (circa 48 ore) e successivo riscaldamento oppure per lunghi periodi mediante congelamento e utilizzato dopo scongelamento (tempo indefinito);
nel primo caso il seme viene diluito e conservato a 5°C; nel secondo il seme viene diluito e congelato a -196°C in azoto liquido.

I vantaggi dei due metodi sono facilmente intuibili:

  • la refrigerazione consente il trasporto del seme;
  • il congelamento, oltre a permettere il trasporto del seme, consente la conservazione per tempo indefinito del materiale genetico.

Gestione materiale seminale (segue)

Nella specie Bovina ormai, nei centri tori, al momento del prelievo il seme, limitando al massimo gli sbalzi termici, viene velocemente trasportato nell’annesso laboratorio e preparato per il congelamento.

Nella specie Equina la situazione è ben diversa, la crioconservabilità del seme di stallone è influenzata infatti, oltre che dai più comuni fattori (gradi di raffreddamento e di congelamento, tipo di crioprotettore, concentrazione crioprotettore, concentrazione seme…) da ulteriori importanti fattori quali le caratteristiche individuali del seme (Stallone), la dose inseminante (volume) e la Stagione di raccolta. In tale specie quindi si predilige ancora l’impiego del seme refrigerato.

Diluizione

Al momento della raccolta il seme va immediatamente diluito in adeguato mestruo al fine di ridurre l’effetto attivante dello stesso plasma seminale utile in vivo all’interno dell’apparato genitale femminile ma dannoso all’aria.

I mestrui diluitori Devono rispettare alcune caratteristiche:

  • Osmolarità compatibile con le cellule spermatiche (300 mOsm circa).
  • pH compatibile con il materiale seminale (pH 7.0).
  • Presenza di tamponi fosfato, tuorlo d’uovo, proteine del latte, Tris, Tes, Hepes.
  • Presenza di proteine (latte, tuorlo d’uovo) aventi azione protettrice nei confronti dell’acrosoma e delle membrane mitocondrali ed in grado di proteggere la cellula stessaa dagli shock algidi.
  • Presenza di zuccheri con funzione energetica.
  • Presenza antibiotici onde evitare contaminazione.
  • Gestione materiale seminale.

Diluizione seme Equino

Nella specie equina al momento del prelievo è consigliata una immediata diluizione a 37°C alla concentrazione di 1 : 3 = seme : extender.

Uno degli extender base impiegato per la fdiluizione del seme equino è costituito come di seguito descritto:

  • latte scremato in polvere 2,4g,
  • glucosio 4,9g, Pennicillina 0.09g,
  • streptomicina 0,15g,
  • 100ml acqua sterile.

Esistono, poi extender commerciali quali:

  • NFDMS glucose (Nonfat Dried Milk Solids).
  • EZ-mixin.
  • INRA 96.
  • EQUIpro.

Diluizione seme Bovino

Extender base per la specie bovina sono:

  • Tris (hydroxymethyl aminomethane);
  • sodium citrate;

addizionati con egg yolk quale fonte proteica.

Extender Commerciali per la specie bovina sono:

  • Andromed.
  • Biladil.
  • Triladil.

Calcolo diluizione

  • Dose inseminante Cavalla 500 x106 spermatozoi progressivamente mobili.
  • Dose inseminante Bovina 10 x106 spermatozoi progressivamente mobili.

Progressively Motile Morphologically Normal (PMMN)
misura necessaria per il calcolo della diluizione da fare

Calcolo PMMN nel bovino, ESEMPIO:
9.5 ml di eiaculato con le seguenti caratteristiche:
75% progressively motile sperm.
80% morphologically normal sperm.
Concentration of 620 million spermatozoa/ml.

Calcolare il numero di spermatozoi nell’eiaculato.
9.5 ml x 620 million/ml = 5.89 billion sperm.

Calcolare il numero di spermatozoi PMMN:
5.89 billion sperm x 75% motile x 80% normal = 3.534 billion PMMN sperm in the ejaculat.

Calcolo diluizione (segue)

Dose inseminante Bovina 10 x106 spermatozoi progressivamente mobili.

Se dobbiamo congelare quale ulteriore parametro va considerata la perdita dovuta alla crioconservazione.
Nel bovino il 50% di spermatzoi viene danneggiato durante il congelamento.
Quindi se diluiamo x congelare la dose minima deve essere raddoppiata.
20 million progressively motile sperm.

Voglio inseminare usando una unica paillette allora:

3.534 billion PMMN = 176 straws
20×106 PMMN/straw

Posso diluire così da preparare 176 paillettes.

L’iter è naturalmente identico per la specie equina in funzione della dose inseminante minima necessaria in tale specie.

Refrigerazione seme Equino

Affinchè il seme possa essere refrigerato va diluito in appositi mestrui, quali quelli commerciali di seguito elencati, previo allontanamento del plasma seminale in toto o in parte (lasciare il 25% sembra garantire la massima sopravvivenza):

  • EZ-mixin.
  • INRA 96.
  • EQUIpro.

Il seme va quindi refrigerato e stoccato a +4°C.

Nella specie equina in tal modo viene garantita una buona qualità dello stesso fino a 48-72h.

Il seme equino refrigerato può essere trasportato in appositi contenitori in grado di garantire la stabilità termica.

Trasporto seme Equino refrigerato

Recipiente per il trasporto.

Recipiente per il trasporto.

Equitainer.

Equitainer.


Congelamento seme

Nel caso in cui il seme debba essere congelato, per prevenire i danni causati dalla formazione di cristalli di ghiaccio possono essere impiegati dei crioprotettori penetranti (glicerolo, DMSO) oppure dei crioprotettori non penetranti (zuccheri e polivinil-pirolidone).

Il crioprotettore maggiormente impiegato per il congelamento degli spermatozoi è il GLICEROLO.

Tale crioprotettore penetrante viene in genere impiegato in concentrazioni variabili dal 2,5 al 7%.

Congelamento seme (segue)

Affinchè il seme possa essere congelato con successo occorre seguire attentamente i passaggi di seguito descritti:

  • Diluizione seme in mestruo con GLICEROLO (in un unico o in più steps a concentrazioni scalari).
  • Caricamento in paillettes.
  • Refrigerazione a +4°C.
  • Esposizione ai vapori d’azoto:
    • in sistema di discesa termica computerizzato.

Congelamento seme (segue)

Il seme da crioconservare va caricato in appositi contenitori che consentono una adeguata discesa termica omogenea in tutto il campione.

Tali contenitori sono le paillettes da 0,5 o da 0,25ml

Paillettes da 0,25ml e 0,5ml.

Paillettes da 0,25ml e 0,5ml.


Congelamento seme (segue)

Sistema di riempimento e di chiusura paillettes.

Sistema di riempimento e di chiusura paillettes.


Congelamento seme (segue)

Identificazione paillettes.

Identificazione paillettes.

Stampatura delle paillettes.

Stampatura delle paillettes.


Congelamento seme (segue)

Sistema di discesa termica computerizzato.

Sistema di discesa termica computerizzato.


Congelamento seme (segue)

Contenitori criogenici.

Contenitori criogenici.


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