Serena Calabrò » 6.Tecnica in vitro della produzione di gas

Tecnica in vitro della produzione di gas

Aspetti generali della IVGPT

• Storia della IVGPT
• Sviluppo di sistemi manuali ed automatici
• Principi su cui si basa la IVGPT

Descrizione generale del metodo

• Preparazione del campione
• Medium
• Inoculum
• Prodotti finali di fermentazione

Che cosa misura la tecnica

• Stechiometria della fermentazione ruminale
• Produzione di biomassa microbica
• Applicazione di un modello matematico ai profili del gas

Aspetti generali della IVGPT

Storia della IVGPT

• 1943 Quin: per valutare l’attività microbica incubò alcuni alimenti con del liquido ruminale in contenitori impermeabili al gas e ne misurò la produzione con un manometro.
• 1963 Johnson: per valutare la degradabilità degli alimenti per ruminanti fu misurato il gas prodotto usando sistemi di rimozione del liquido.
• 1974 O’Hara et al.: per facilitare le misurazioni con i manometri, misurarono la produzione del gas per mezzo una siringa graduata fissata ad una beuta in cui il substrato stava fermentando; ed osservarono che la produzione di gas variava con il substrato utilizzato.

Sistemi manuali per la registrazione del gas

1991 Theodorou et al. presso l’Istitute of Grassland and Enviromental Research in Inghilterra (IGER) → semplice metodo manuale:

• Bottiglie da siero, chiuse ermeticamente con tappi di butile e ghiere di alluminio, contenenti il substrato da testare e l’inoculo ruminale tamponato, un trasduttore di pressione connesso, tramite una valvola, ad un dispositivo a tre uscite, per misurare il gas dello spazio di testa delle bottiglie (1a: il trasduttore, 2a: ago ipodermico per collegare la bottiglia al trasduttore, 3a: siringa graduata in accordo con la quantità di gas da misurare).
• Il trasduttore, collegato ad un voltmetro con scala modificata a lettura digitale, misura la pressione riportata sul display direttamente in p.s.i. (pound/square inch). Con l’ago inserito nel tappo di gomma della bottiglia il sistema permette quindi di apprezzare la pressione interna, di misurare il corrispondente volume di gas sviluppato, rilasciando lo stantuffo della siringa graduata, nonché di svuotare il sistema fino ad equilibrare la pressione interna con quella atmosferica, come indicato dalla lettura zero sul display del voltmetro.
• La pressione ed il volume di gas vengono registrati ad intervalli regolari, ogni 2-4 h nelle prime 24 h, e poi meno frequentemente fino al termine dell’ incubazione che si protrae fino a 96, 120 o 144 ore; il gas prodotto durante la fermentazione è rimosso dopo ogni lettura.

Trasduttore di pressione

Sistemi automatici

• Beuvink et al. (1992) presso l’Institute of Animal Science and Health, (Lelystad, Paesi Bassi): peso del fluido spostato dal gas di fermentazione in 24 bottiglie individuali la variazione di peso registrata è utilizzata per convertire il peso in volume.
• Pell e Schofield (1993) presso la Cornell University (USA): uso di sensori di pressione computerizzati; con questa tecnica il gas prodotto non viene eliminato durante la fermentazione ma rimane nello spazio di testa delle bottiglia.
• Cone et al. (1996) presso il ID-DLO di Lelystad (Paesi Bassi) hanno descritto una apparecchiatura completamente automatica sviluppata combinando il trasduttore di pressione e le valvole elettroniche.
• Davies et al.(1995) presso IGER: una versione automatica del sistema manuale denominato Automated Pressure Evaluation System (APES).
  • Il sistema è formato da 48 bottiglie collegate ognuna ad un sensore di pressione, ad una valvola a solenoide e al computer.
  • Durante le fermentazioni, quando il sensore registra una pressione prestabilita, le valvole si aprono e lasciano uscire il gas prodotto, il numero di sfiati ed il tempo fra gli stessi vengono registrati automaticamente dal computer e sono usati per tracciare un profilo cumulativo del gas.

Automated pressure evaluation system (APES)

Microbiologia ruminale II

• La popolazione microbica del rumine ricava l’energia per lo sviluppo dalla fermentazione
  • dai carboidrati di struttura [cellulosa che non può essere digerita dagli animali perché non possiedono enzimi adatti a scindere i legami β(1→4) presenti tra le molecole di glucosio];
  • dai carboidrati di riserva [amido che può essere digerito anche dagli animali grazie alla presenza di enzimi in grado di rompere i legami β(1→4)].
• Dopo la prima fase di fermentazione si ha la produzione di zuccheri semplici (glucosio, fruttosio, xilosio) a partire dalla cellulosa, dalle emicellulose, dall’amido, e dai fruttosani.
• Attività fermentativa analoga la possiamo riscontrare nell’intestino crasso che non produce enzimi digestivi ma è sede di una intensa attività microbica, che assume un ruolo notevole nella digestione in specie erbivore monogastriche (es. coniglio e cavallo).

Descrizione generale del metodo

• La IVGPT è simile ad altre procedure in vitro che studiano la digeribilità e prevede l’utilizzo di:
  • substrati (alimenti macinati);
  • medium anaerobico;
  • inoculo ottenuto da una popolazione microbica ruminale.
• Il substrato prepesato è sospeso nel medium, e in un campione fresco di liquido ruminale (aggiunto come inoculum) alla temperatura di 39°C ed in condizioni di anaerobiosi.
• Da questo momento, la produzione di gas che deriva dalla fermentazione viene registrata o alla fine della fermentazione, oppure ad intervalli regolari di tempo, per quei metodi che misurano la cinetica di fermentazione.

La preparazione del campione

• Importante e può influenzare i risultati; particelle di piccole dimensioni aumentano la superficie disponibile per la degradazione microbica.
• La maggior parte degli autori macinano i substrati da testare tramite una griglia da 1 mm, in linea con altri metodi in vitro (Tilley e Terry, 1963; Goering e Van Soest, 1970).
• Molti autori liofilizzano i campioni freschi (che nel caso degli insilati, può condurre alla perdita delle componenti volatili) o essiccano a basse temperature: 60°C o 70°C.
• Alcuni autori, nell’ambito di questa problematica hanno incubato campioni di insilati freschi ed essiccati ed hanno ottenuto differenze nella cinetica di fermentazione:
  • maggiore gas e minore velocità di fermentazione nei campioni incubati freschi rispetto a quelli essiccati.
• Differenti temperature di essiccazione (30, 50, 70 e 105°C) influenzano la cinetica di fermentazione di gambi di mais e di graminacee; la liofilizzazione è da preferire all’essiccazione.

Medium

• Il rumine fornisce un ambiente ideale per i microrganismi anaerobi in termini di pH, temperatura, potere tampone ed azoto.
• Tutti i medium utilizzati hanno alcune caratteristiche in comune:
  • soluzione tampone a base di fosfato e bicarbonato;
  • agente riducente che abbassa il potenziale di ossido-rduzione;
  • fonte di azoto;
  • vari elementi minerali (macro e micro elementi);
  • resazurina, come indicatore del potenziale di ossidoriduzione.
• Durante le fasi di preparazione del medium è necessario sottoporre lo stesso ad un flusso di CO₂ al fine di eliminare l’ossigeno presente e garantire un basso potenziale di ossido-riduzione al momento dell’inoculazione.
• L’assenza di anaerobiosi provoca una parziale perdita dei batteri cellulosolitici ed amilolitici; tutti i sistemi in vitro, usati per valutare la cinetica di digestione della fibra, devono prevedere un continuo flusso di CO₂ e la presenza di agenti riducenti per promuovere un inizio veloce della fermentazione e la progressione della stessa.

Inoculo II

• Momento della raccolta del LR: Il LR preso dopo una notte di digiuno è meno attivo di quello preso alcune ore dopo l’alimentazione, ma è più costante in termini di attività e composizione. Generalmente la raccolta del LR viene effettuata prima dell’alimentazione del mattino.
• Preparazione dell’inoculo: il LR deve essere omogeneizzato e filtrato prima dell’inoculazione; questa procedura aumenta il numero di batteri nell’inoculo permettendo il recupero di anche quelli aderenti all’alimento (per lo più specie cellulosolitiche), ma può anche aumentare la presenza di piccole particelle di alimento, che possono influenzare la produzione di gas. L’omogeneizzazione inoltre può anche aumentare il rischio di esposizione all’O₂ se il flusso della CO₂ non è sufficiente.
• Diluizione LR e medium: la proporzione di LR è stata studiata da vari autori che hanno suggerito una quantità di LR pari al 20% del volume totale; tuttavia la quantità di inoculo aggiunto varia ampiamente fra i gruppi di ricerca.

Prodotti finali di fermentazione

• Produzione di gas: Il gas prodotto dalle fermentazioni dei carboidrati può essere misurato alla fine dell’incubazione oppure ad intervalli regolari di tempo. Questi ultimi dati vengono interpolati con opportuni modelli matematici in grado di fornire parametri cinetici.
• Degradabilità della sostanza organica (dSO): La determinazione della dSO è da preferire a quella della sostanza secca poiché le ceneri non producono gas. La SO residua viene determinata alla fine dell’incubazione filtrando il liquido di fermentazione su crogioli di vetro prepesati a setto poroso (porosità #2), essiccando in stufa a 103°C ed incenerendo in muffola a 550°C; la dSO viene ottenuta per differenza tra quella incubata e quella residua.
• pH: alla fine dell’incubazione si effettua la sua determinazione per controllare che non si siano verificate fermentazioni anomale e che il sistema tampone sia stato efficace. Valori di pH superiori a 6.2 garantiscno l’attività dei cellulosolitici; alcuni autori hanno ritrovato valori più bassi quando i substrati incubati erano granelle di cereali.

Prodotti finali di fermentazione II

• Acidi grassi volatili (AGV): A seguito dell’attività fermentativa della popolazione microbica vengono prodotti acidi grassi volatili (ac. acetico, propionico, butirrico, iso-butirrico, valerianico e iso-valerianico) che vengono determinati mediante gascromatografo su campioni del liquido di fermentazione. La determinazione della produzione totale di AGV e delle loro concentrazioni molari, del rapporto tra acetato e propionato e di quello tra gli acidi grassi a catena ramificata permettono una valutazione più approfondita del processo fermentativo.
• Ammoniaca (NH₃): la determinazione dell’ammoniaca alla fine dell’incubazione può risultare utile per ottenere maggiori informazioni circa la degradazione a carico delle proteine; in genere viene effettuata in prove di IVGPT che studiano gli aspetti più microbiologici delle fermentazioni. La determinazione può essere effettuata mediante appositi kit o con il metodo dell’indofenolo (reazione di Berthelot) e successiva quantificazione allo spettrofotometro.

Che cosa misura la IVGPT

La produzione in vitro di gas si riferisce solamente alle fermentazioni che avvengono nel rumine ad opera dei batteri, dei protozoi e dei funghi che lo abitano, e non alla digeribilità di tutto il tratto digestivo, che include la digestione enzimatica, l’assorbimento ed ulteriori fermentazioni.

• Stechiometria della fermentazione ruminale
• Produzione di biomassa microbica

Stechiometria delle fermentazioni ruminali

• Le reazioni stechiometriche di fermentazione degli esosi provenienti dai carboidrati complessi della cellula vegetale sono state descritte da Hungate (1966):
  • 1 mol di esoso + H₂O → 2 acetato + 2CO₂ + 4H₂
  • 1 mol di esoso + H₂ → 1 propionato + 2H₂O
  • 1 mol di esoso → 1 butirrato + 2CO₂ + 2H₂
  • CO₂ + 4H₂ → CH₄ + 2H₂O
• Quella che porta alla formazione di acido propionico è l’unica reazione che richiede idrogeno (H₂); tutto l’H₂ restante è convertito solitamente in CH₄ dai batteri metanogeni; inoltre, la produzione di propionato non determina la formazione di CO₂.
• Il bilancio completo relativo alla fermentazione di un esoso in diete ad alto contenuto in foraggio:
  • 1 mol di esoso → 1.34 mol di acetato + 0.45 mol di propionato + 0.11 mol di butirrato + 0.61 mol di CH4 + 4.62 mol di ATP

Stechiometria delle fermentazioni ruminali II

Nelle IVGPT basate sulla misura della pressione in un recipiente a volume costante, si può applicare l’equazione universale dei gas:

P·V = n·R·T

dove:

• P = pressione di gas (atmosfera)
• V = volume di gas (litri)
• n = numero moli di gas
• R = costante universale dei gas a 0°C ed a 760 mm Hg (0.082 moli)
• T = temperatura (°K)

Nella maggior parte degli studi, il volume del gas a 39°C è misurato alla pressione di 1 atmosfera, per cui che 1 mmol di gas occupa un volume di 25,62 ml.

Produzione di biomassa microbica

• Può esistere un rapporto inverso fra il volume del gas (o di AGV) e la produzione di biomassa microbica.
• Il tipo di carboidrato e la relativa velocità di fermentazione potrebbero influenzare la sintesi totale di proteina microbica per unità di volume di gas prodotto.
• L’efficienza di sviluppo microbico può variare in funzione della dieta e, se non si vengono a creare carenze di fattori di sviluppo microbico, sia la fonte dei carboidrati (zucchero, amido o fibra) sia la velocità di transito ruminale hanno poco effetto sul rendimento dello sviluppo microbico; gli apporti di carboidrati fermentescibili e di proteina possono influenzare l’efficienza di sviluppo microbico (es. un alto rapporto proteina-carboidrato _ rapporto relativamente basso tra proteina microbica e AGV).
• Più approfondite informazioni si possono ottenere dalla IVGPT associando ad essa la determinazione di AGV, NH₃ e produzione di proteina microbica.
• Rapporto fra produzione di gas e sviluppo microbico: alcuni substrati (es. esempio con foraggi a basso contenuto in azoto) producono molto gas e hanno rendimenti bassi in biomassa.

Applicazione di un modello matematico ai profili del gas

• Per valutare in maniera obiettiva e confrontare le cinetiche di produzione di gas dei diversi alimenti, risulta necessario disporre di un opportuno modello matematico che descrive le quantità cumulative di gas prodotte ai vari tempi di incubazione.
• Qualunque sia il modello utilizzato, oltre ad essere idoneo a descrivere i dati sperimentali, deve anche fornire parametri che abbiano un chiaro significato biologico.

Applicazione di un modello matematico ai profili del gas II

Modello di Ørskov-McDonald: Y = Y_∞exp [e·k ^(λ-t)]

• Y = produzione di gas al tempo t
• Y_∞ = asintoto della curva, ovvero produzione potenziale totale di gas
• k = velocità relativa
• t = tempo
• λ = tempo di latenza

Il modello è relativo ad una cinetica di reazione del primo ordine e presuppone che la velocità relativa di produzione del gas sia costante e coincidente il valore medio.

Applicazione di un modello matematico ai profili del gas III

Modello logistico: Y= Y_∞/1 + exp ^2+4μ m/V^(λ-t)

• I simboli hanno lo stesso significato dell’equazione precedente e μ_m è uguale alla velocità massima di produzione di gas.
• Tale modello presuppone che la velocità di produzione del gas sia proporzionale all’attività microbica, ovvero, alla quantità di gas sviluppato e alla concentrazione del substrato.

Applicazione di un modello matematico ai profili del gas IV

Modello di Gompertz: Y_∞=Y_∞exp [ - exp ^{1+eμ_m/V_F(λ-t)}]

• È fondato sullo stesso principio di quello logistico.
• L’attività microbica diminuisce con il tempo secondo una cinetica di primo ordine.

Applicazione di un modello matematico ai profili del gas V

Modello di Groot: G =∑ A_i/1+B_iC_i/tc_i

• Groot et al. (1996) hanno proposto un’equazione sigmoidale che permette, come i due ultimi modelli, di evidenziare la cinetica di più fasi eventualmente presenti nella curva di produzione del gas:
  • G = volume di gas prodotto (ml/g) al tempo t;
  • A = produzione totale di gas ottenibile dalla fase i esima (ml/g);
  • B = tempo di incubazione necessario ad ottenere una quantità di gas pari ad A/2;
  • C = costante che determina la forma della curva;
  • i = numero di fasi.
• Inizialmente si applica un modello mono-fasico e si valuta la bontà dell’adattamento, nonché la significatività dei vari parametri della curva. Successivamente, si applica il modello bi-fasico e la seconda fase viene aggiunta solamente quando tale operazione porta a miglioramenti significativi dell’adattamento e i parametri sono significativamente diversi da zero; allo stesso modo si procede

Profilo della produzione di gas e adattamento con un modello mono- e bi- fasico di una dietacon rapporto F/C = 80/20

Parametri cinetici

Informazioni dalla IVGPT

• La IVGPT, quindi, fornisce per ciascun alimento informazioni
  • di tipo statico: degradazione della sostanza organica, produzione potenziale di gas, produzione di acidi grassi volatili;
  • di tipo cinetico: (tempo necessario a produrre una quantità di gas pari a ½ di quella potenziale). Inoltre, utilizzando i parametri della curva è possibile stimare la velocità di produzione del gas a ciascun tempo di incubazione, nonché la velocità massima. Ottenendo così informazioni molto dettagliate sull’entità e sulla cinetica di degradazione del substrato incubato.