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Serena Calabrò » 7.Utilizzazione della IVGPT negli studi di nutrizione animale


Introduzione

  • Stima del valore nutritivo degli alimenti
  • Cinetiche di fermentazione delle frazioni glucidiche degli alimenti
  • Influenza dell’aggiunta di grasso sulla degradabilità ruminale
  • Effetto dei fattori antinutrizionali
  • Effetti associativi nelle diete per ruminanti
  • Monitoraggio della flora microbica ruminale
  • Sincronizzazione dei nutrienti
  • Valutazione di alimenti geneticamente modificati

Relazione tra dati di fermentazione in vitro e parametri in vivo

Utilizzazione della IVGPT in altre specie animali

Vantaggi, limiti e prospettive future della IVGPT

Stima del valore nutritivo degli alimenti

  • Menke e Steingass (1988), confrontando i dati di composizione chimica di una vasta gamma di alimenti, con i dati ottenuti in vitro in circa 400 prove di IVGPT, propongono ottime equazioni di regressione che permettono di stimare il valore nutritivo (ENL) di foraggi e concentrati per ruminanti in funzione di alcuni parametri della composizione chimica (PG, EE, ceneri e EI) e della quantità di gas prodotto dopo 24 ore (G24) di incubazione in vitro con un inoculo ruminale.
  • La IVGPT viene impiegata con successo in Germania per valutare il contenuto di energia metabolizzabile e netta degli alimenti.

Concentrati
ENL= -0.36 + 0.1149·G24 + 0.0054 · PG + 0.0139 · EE – 0.0054 · CENERI
Foraggi
ENL= 0.54 + 0.0959 · G24 + 0.0038 · PG + 0.0001733 · PG2
Fieni
ENL= 0.081 + 0.00816 · G24 + 0.0046 · PG + 0.0135 · EE

Cinetiche di fermentazione degli alimenti

  • La cinetica di fermentazione dei costituenti chimici degli alimenti (glucidi) è uno dei fattori che influenza l’ingestione volontaria dei stessi da parte dei ruminanti ed esprime lo sviluppo dei microrganismi e l’attività dei loro enzimi.
  • La IVGPT è la metodica ideale per studiare le cinetiche di fermentazione delle frazioni glucidiche degli alimenti.
  • Pell e Schofield (1993) hanno confrontato le cinetiche di fermentazione di tre foraggi (Medicago sativa, Bromus inermis, Dactylis glomerata) evidenziando le modifiche dovute all’insilamento.
  • Stefanon et al. (1996) hanno studiato l’influenza della maturità della pianta in foraggi di medica e bromo.
  • Alcuni autori hanno usato la IVGPT per valutare gli effetti di alcuni trattamenti tecnologici subiti da granelle di cereali e leguminose sulle caratteristiche di fermentazione.

Andamento della velocità di fermentazione nell’erbaio veccia-avena


Andamento della produzione di gas in cereali interi e fioccati

Fonte: De Peters et al. (2005)

Fonte: De Peters et al. (2005)


Cinetica di fermentazione delle frazioni glucidiche

  • Alcuni autori (Pell et al., 1998; Chen et al., 1999) hanno proposto di utilizzare la IVGPT nell’ambito del CNCPS (Cornell Net Carbohydrate and Protein System), per determinare la velocità di fermentazione delle frazioni glucidiche.
  • Il CNCPS classifica le proteine e i carboidrati contenuti negli alimenti in funzione della loro risposta all’azione dei microrganismi ruminali, le proteine in cinque frazioni (A; B1; B2; B3; C) e i carboidrati in quattro frazioni (A; B1; B2; C).

Cinetica di fermentazione delle frazioni glucidiche

A tale scopo vengono incubati separatamente l’alimento tal quale, la sua NDF opportunamente isolata ed il suo residuo insolubile in etanolo (EIR); utilizzando il metodo di sottrazione delle curve, si ottengono le cinetiche di degradazione di ognuna delle tre frazioni di glucidi fermentescibili:
A (zuccheri solubili = foraggio intero – EIR)
B1 (amido = EIR – NDF)
B2 (fibra degradabile = NDF).


Influenza del grasso sulla degradabilità ruminale

  • Il grasso giallo ed il sego sono sottoprodotti che vengono adoperati come integratori energetici nelle diete di vacche in lattazione; anche alimenti con elevati livelli di grasso residuo (es. crusca di riso) sono comunemente impiegati nelle diete per i ruminanti.
  • La IVGPT è stata impiegata da Getachew et al. (2001) per valutare l’effetto dei grassi aggiunti alla razione sulla produzione di gas e sulle fermentazioni ruminali degli alimenti:
    • gli acidi grassi sotto forma di sali di potassio, poichè si rendono prontamente disponibili per i microbi come acidi grassi liberi nel liquido ruminale, deprimono la produzione di gas anche a piccole quantità, con effetti dannosi sullo sviluppo microbico.
    • gli acidi grassi contenuti nei trigliceridi, invece, vengono rilasciati a seguito di processi di idrolisi degli esteri, e quindi si rendono disponibili più lentamente; non hanno effetto sulla produzione di gas quando la dieta ne contiene fino al 25%.

Effetto dei fattori anti-nutrizionali

  • Alcuni alimenti comunemente impiegati in diete per ruminanti (es. foraggi tropicali e di leguminose e semi di cotone) contengono composti fenolici, terpeni, alcaloidi, steroidi e saponine che hanno effetti biologici negativi sullo sviluppo delle popolazioni del rumine.
  • Altri residui polifenolici naturali come i tannini sono contenuti in alcune piante, e possono diminuire la digeribilità dell’alimento nel rumine formando complessi tra alimento e proteine microbiche.
  • L’effetto dei tannini sul valore nutritivo degli alimenti è stato studiato in vitro con il metodo delle siringhe di Menke da Makkar et al. (1995) usando degli agenti tannino-leganti, quale il glicole polietilene (PEG), che si lega fortemente ai tannini ed inibisce i loro effetti biologici:
    • dopo 24 ore di incubazione, l’aumento della produzione di gas è risultato ben correlato (r = 0.95) con la capacità di precipitazione delle proteine da parte dei tannini presenti nelle piante.

Foglie di specie legnose e cespugli

Balogum et al. (1998)  Sangaré et al. (2003)

Balogum et al. (1998) Sangaré et al. (2003)


Effetti associativi nelle diete per ruminanti

  • Le razioni somministrate agli animali sono miscele di diversi alimenti, con un gran numero di combinazioni possibili, il cui valore energetico viene calcolato generalmente sommando i valori di energia dei diversi alimenti che la compongono, supponendo che il valore energetico specifico di ogni l’alimento è lo stesso in ogni combinazione possibile con altri alimenti, tuttavia questo non è sempre vero.
  • Per esempio, quando un foraggio di cattiva qualità quale la paglia è somministrato ad un ruminante, la relativa digeribilità è bassa, ma aggiungendo azoto sotto forma di urea o proteina, la digeribilità della paglia aumenta e di conseguenza l’energia che ne deriva dalla sua materia organica.

Effetti associativi nelle diete per ruminanti

  • Infascelli et al. (2005), in una prova di IVGPT condotta su tre diete per bufale, ha confrontato i risultati ottenuti dalle diete con quelli stimati a partire dai dati ottenuti per i singoli alimenti costituenti le diete stesse.
  • Mentre non sono emerse differenze tra i valori determinati e quelli stimati per quanto riguarda la dSO e il gas a 120 ore, alcuni parametri cinetici determinati sono risultati significativamente diversi da quelli stimati.
  • Gli autori concludono che a tali differenze hanno sicuramente contribuito gli effetti associativi degli alimenti.

Monitoraggio della flora microbica ruminale

  • L’IVGPT permette di studiare i fattori che influenzano le popolazioni microbiche del rumine.
  • La conoscenza di questi meccanismi permette di “manipolare” la microflora del rumine allo scopo di aumentare l’utilizzazione degli alimenti attraverso:
    • maggiore degradazione della fibra
    • maggiore efficienza di utilizzazione dell’azoto
    • degradazione di fattori antinutrizionali e sostanze tossiche presenti negli alimenti.
  • Questi sistemi di fermentazione controllati potrebbero essere impiegati in combinazione con l’ingegneria genetica applicata alle piante per risolvere i problemi di rendimento animale.
  • La IVGPT potrebbe essere impiegata insieme ad analisi molecolari, come la reazione a catena della polimerasi (PCR) e l’uso di sonde specifiche dell’acido ribonucleico (RNA), con la possibilità di studiare lo sviluppo dei microrganismi nel rumine, al fine di aumentare efficienza di utilizzazione degli alimenti e ridurre l’impatto ambientale.
  • Muetzel e Becker (2003) hanno usato la IVGPT, in combinazione con le sonde dell’RNA ribosomale, per misurare l’efficienza di sviluppo microbico in ruminanti alimentati con paglia d’orzo foglie di leguminose.

Sincronizzazione dei nutrienti

  • Per ottenere un migliore sviluppo microbico le fonti di azoto e di carboidrati devono essere somministrate simultaneamente.
  • Le concentrazioni ruminali di ammoniaca possono essere influenzate dalla velocità di degradazione dei carboidrati e dai composti contenenti azoto; un aumento della velocità di degradazione delle proteine della dieta comporta l’innalzamento della concentrazione ruminale di ammoniaca mentre un aumento del tasso di degradazione dei carboidrati la fa diminuire.
  • L’aumento della disponibilità di carboidrati per le fermentazioni promuove lo sviluppo microbico e di conseguenza meno azoto è perso dal rumine sotto forma di azoto ammoniacale (Getachew et al., 2000).
  • La IVGPT offre l’opportunità di studiare i fabbisogni microbici di azoto e carboidrati, al fine di ottenere efficienti attività fermentative.

Valutazione degli alimenti GM

  • Molti foraggi e granelle sono stati geneticamente modificati per aumentarne la loro produzione, o migliorare in essi il contenuto di alcuni nutrienti di cui sono normalmente carenti:
    • i foraggi sono stati selezionati per ottenere una maggiore digeribilità della fibra
    • l’amido di alcuni cereali (es. mais) è protetto da una matrice proteica che ne riduce l’attacco enzimatico, oggi esistono alcune nuove varietà genetiche di mais con la matrice proteica modificata.
  • La IVGPT è stata impiegata per indagare se queste nuove varietà GM influenzano l’entità e la velocità di degradazione nel rumine.
  • Tudisco et al. (2004) riporta che le modificazioni genetiche non hanno influenzato la composizione chimica di soia e mais, ma quest’ultimo ha mostrato una cinetica di fermentazione più veloce; la soia GM, invece, ha mostrato una produzione di gas (reale e potenziale) più bassa.

Relazione tra dati di fermentazione e parametri in vitro

  • Numerosi autori hanno studiato le correlazioni tra i dati di degradabilità in vitro e vari parametri in vivo, quali la digeribilità della SO e l’ingestione di alimento, ottenendo spesso buone stime.
    • Blümmel e Ørskov (1993) hanno correlato la produzione totale di gas di 10 paglie con l’ingestione (r = 0.88) e la digeribilità (r = 0.93) di sostanza secca e con la velocità di accrescimento (r = 0.95) di montoni alimentati con i suddetti alimenti.
    • Blümmel e Beker (1997) hanno evidenziato che il 75% della variabilità dell’ingestione del foraggio è spiegata dalla produzione di gas dopo 8 ore di incubazione in vitro dell’alimento con un inoculo ruminale.

Relazione tra dati di fermentazione e parametri in vitro

  • Nonostante, come riportato da vari autori i parametri in vivo e in vitro risultano statisticamente ben correlati, bisogna considerare che i due sistemi forniscono risultati con significati biologici diversi:
    • la degradabilità ottenuta in vitro riguarda solo il rumine e non tutto il tratto gastro-intestinale;
    • la IVGPT utilizza un sistema chiuso a differenza del rumine in cui è presente un continuo flusso di nutrienti;
    • la digeribilità è influenzata anche da alcuni fattori quali la scelta dell’animale che si verifica solo in vivo.
  • Nonostante le buone correlazioni, sarebbe riduttivo utilizzare la IVGPT solo per ottenere dati che riguardano il punto finale della fermentazione piuttosto che utili informazioni riguardanti la cinetica di degradazione degli alimenti (Williams, 2000).

IVGPT in altre specie animali

  • Suini: Awati (2005), in un progetto di ricerca riguardante il ruolo dei probiotici nell’alimentazione dei suini, ha impiegato la IVGPT in alternativa alle tradizionali culture batteriche per studiare l’attività della popolazione microbica del grosso intestino incubando carboidrati fermentescibili (es. oligofruttosaccaridi, mannosio, inulina, lactulosio, ecc.) e determinando i prodotti della fermentazione (ac. lattico, AGV, NH3).
  • Polli: Guo et al. (2003), usando come inocuulm il contenuto cecale dell’intestino dei polli, ha condotto studi sulla cinetica di fermentazione dei carboidrati contenuti in due ceppi fungini (Lentinus edodes, Trenella fuciformis), e di un erba medicinale (Astragalus membranaceus) con proprietà immunostimolanti, al fine di verificare i loro effetti sull’attività della flora microbica intestinale.

IVGPT in altre specie animali

  • Cavalli: Macheboeuf et al. (1998), utilizzando la IVGPT con feci di cavallo come inoculum, ha stimato la digeribilità della sostanza organica (OMD) dei foraggi in maniera al quanto soddisfacente:
    • per il fieno di medica la OMD fu positivamente correlata alla produzione di gas a 24 h (R2 = 0.68, DSR = 2.5, P<0.05), e la stima risultò migliore utilizzando la velocità di fermentazione (R2 = 0.96, DSR 0.9, P<0.001).
  • Conigli: La IVGPT con un inoculum ottenuto dall’intestino cieco di conigli è stata utilizzata in uno studio preliminare da Stanco et al. (2003) per valutare la digeribilità della sostanza secca e organica, nonché il contenuto in energia lorda di trentuno alimenti per conigli.
  • Cani: Cutrignelli et al. (2007) ha utilizzato la IVGPT per confrontare l’attività microbica di due razze diverse, Pastore tedesco e Mastino Napoletano, impiegando probiotici a diversa fermentescibilità come substrati.
  • Struzzi: la IVGPT è stata utilizzata per studiare la digeribilità in vitro degli alimenti, impiegando il contenuto cecale come fonte di inoculo (Bovera et al., 2007).

Vantaggi della IVGPT

  • La IVGPT permette un’analisi molto dettagliata degli alimenti di interesse zootecnico e presenta molti vantaggi in termini di:
    • costo
    • benessere animale
    • dimensione del campione
  • Dimensione del campione
    • La quantità di materiale richiesta è veramente minima e varia, tra i vari gruppi di ricerca, da 0,1 a 1 g.
  • Costi
    • I costi delle prove in vitro sono solitamente molto più bassi di quelli richiesti per le prove in vivo. Solo l’apparecchiatura per i sistemi automatici è abbastanza costosa, ma poiché in questi casi il lavoro di laboratorio per effettuare le prove è notevolmente ridotto i costi legati all’acquisto vengono in parte ammortizzati. Largo impiego nei paesi con poca disponibilità di risorse.
    • La IVGPT richiede gli animali solo come fonte di LR; per gli elevati costi di gestione e la crescente attenzione rivolta al benessere animale da parte dell’opinione pubblica e dei ricercatori.
    • Indagini per valutare se le feci possono essere usate come fonte alternativa di inoculo. Approccio non invasivo: i dati ottenuti con la IVGPT utilizzando le feci come inoculo vengono impiegati per stimare la cinetica di fermentazione relative al LR applicando un opportuno modello matematico.

Confronto fra LR e feci

  • vacche alimentate con una dieta a base di insilato: inoculo fecale valori significativamente più bassi di gas, AGV e dSO.
  • bufalo fieno di avena, farina di mais e soia f.e. incubati con i due inoculi nessuna differenza significativa per dSO e la maggior parte dei parametri fermentativi; solo la velocità massima di produzione di gas è significativamente più elevata con le feci.
  • Ulteriori studi in questa direzione sono necessari per confermare la possibilità di utilizzare le feci in alternativa al LR, considerando che la popolazione microbica presente nelle feci è probabilmente diversa da quella del LR (meno attiva, più concentrata e più esposta all’ossigeno).

Limiti della IVGPT

  • Mancanza di uniformità tra i laboratori di ricerca nei protocolli di laboratorio difficile confrontare i risultati ottenuti da vari gruppi.
  • Per ovviare a tale inconveniente è necessaria una standardizzazione della tecnica riguardante:
    • medium (concentrazione ideale da utilizzare, composizione, ecc.)
    • inoculum (momento ideale della raccolta del LR, tecnica di preparazione, ecc.)
    • dieta da somministrate agli animali donatori del LR.

Limiti della IVGPT

  • Utilizzo di substrati standard (es. cellulosa e amido), al fine di correggere le differenze esistenti tra i diversi laboratori.
  • Ring test” tra vari gruppi di ricerca:
    • nel 1996: nove laboratori, tra cui quelli presenti presso l’IGER (UK), l’ADAS (UK), l’Università di Wageningen (NL) e la Cornell University (USA), hanno incubato in vitro cellulosa, soia f.e., orzo e un fieno, ciascun gruppo seguendo i propri protocolli metodologici. I risultati di queste collaborazioni evidenziano molte differenze metodologiche tra i vari gruppi di ricerca; i ricercatori interessati a questo settore, quindi, si prefiggono di confrontarsi periodicamente per migliorare i vari aspetti della metodica.
    • nel 2007: Commissione ASPA “Studio e messa a punto delle migliori tecniche in vitro per la caratterizzazione degli alimenti e lo studio dei processi digestivi negli animali domestici”.
  • Altri particolari importanti che ancora devono essere studiati riguardano i rapporto fra gas, AGV e produzione microbica all’interno del sistema in vitro.

Prospettive future

  • La necessità di valutare le caratteristiche nutritive degli alimenti per animali aumenta sempre di più nel corso degli anni, e per tale motivo è necessario sviluppare tecniche all’avanguardia, che tengano conto sia delle esigenze della flora microbica che degli animali stessi.
  • La determinazione della cinetica di fermentazione degli alimenti, essendo un’analisi abbastanza semplice da effettuare con le moderne tecniche, diverrà molto probabilmente l’elemento su cui si baseranno molti sistemi futuri.
  • Alcuni ricercatori stanno conducendo studi combinando la IVGPT con l’analisi degli alcani nei foraggi per misurare l’ingestione al pascolo nelle vacche da latte. Tale metodologia potrebbe essere usata in futuro per studiare il valore degli alimenti consumati dagli animali selvatici, analizzando gli alcani presenti nelle loro feci ed effettuando degli studi di fermentazione sulle piante di cui essi si alimentano.

Prospettive future

  • Oltre alle normali valutazioni di routine sugli alimenti, alcuni ricercatori stanno sperimentando l’uso della IVGPT per studiare le attività fermentative dei carboidrati di struttura e non che avvengono nei diversi siti del tratto gastrointestinale (GIT) di molti animali (anche pesci).
  • Risultati interessanti si stanno ottenendo dalla combinazione della IVGPT con le moderne biotecnologie oggi disponibili (PCR).
  • Altri gruppi di ricerca avvalendosi della IVGPT stanno conducendo studi sul lievito e sui prodotti di fermentazione dello stesso che di frequente sono aggiunti alla dieta delle vacche in lattazione come modificatori della flora microbica. Il meccanismo d’azione dei lieviti e dei loro prodotti di fermentazione non è ancora del tutto chiaro; studiando gli effetti dei modulatori della flora microbica ruminale sulle fermentazioni microbiche mediante la IVGPT, si potrebbero chiarire questi aspetti e quantificare gli effetti sulla produzione lattiero-casearia.

Prospettive future

  • Associare gli studi condotti per migliorare l’efficienza di utilizzazione degli alimenti alla possibilità di ridurre le emissioni di nitrati e sostanze organiche nell’ambiente. Tali sostanze oltre a generare fastidiosi odori che disturbano le aree residenziali, sono anche responsabili dell’inquinamento delle falde freatiche e dei corsi d’acqua superficiali (laghi, fiumi, aree costiere).
  • Particolare interesse assume lo studio della composizione quantitativa del gas prodotto durante i processi fermentativi (CO2, CH4, H2), al fine di predisporre eventuali piani alimentari, che tra l’altro diminuiscono la produzione di metano, uno dei gas più implicati nell’effetto serra.

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