Giuseppe Castaldo » 1.Il campione biologico: modalita del prelievo e conservazione del sangue

Il campione biologico: generalità

Per eseguire le analisi di biochimica clinica in maniera ottimale e per fruire al meglio del dato analitico è necessario che al laboratorio venga fornito il campione, siglato e raccolto in maniera idonea in relazione all’esame richiesto e il modulo di richiesta dettagliato ed interamente compilato. Questo assicura che

1. venga eseguito l’esame necessario,
2. che siano puntualizzati i valori di riferimento in base al sesso ed età del soggetto,
3. che siano valutate eventuali interferenze sul risultato,
4. che il risultato analitico sia prodotto nel minor tempo possibile.

Il campione biologico

Possono essere oggetto degli esami di laboratorio di biochimica clinica tutti i campioni biologici (fluidi, tessuti, frammenti bioptici) purchè siano rappresentativi dei sistemi da investigare.

La scelta del campione biologico dipende dalle indagini da eseguire.

I campioni di solito utilizzati sono i campioni di sangue e i campioni di urine. Per le indagini ematologiche e biochimico-cliniche di routine si utilizza preferibilmente il sangue venoso, mentre il sangue arterioso viene utilizzato per lo studio dei parametri dell’equilibrio acido-base.

Per alcuni esami può essere richiesto l’uso di specifici campioni biologici, quali: feci, fluido cerebrospinale (LCS), biopsie di tessuto o cellule, calcoli, aspirato (fluido della pleura, asciti, fluido sinoviale, fluido intestinale…), liquido amniotico.

La richiesta degli esami di Biochimica Clinica

Il modulo di richiesta, oltre alle notizie anagrafiche (nome, cognome, provenienza, età, sesso) e nosografiche (struttura clinica di provenienza, medico richiedente di riferimento), deve riportare sia notizie reletave al paziente che relative al prelievo, quali:

1. il sospetto diagnostico; ciò permette di definire l’urgenza dell’esame (dato che in alcuni laboratori esistono linee analitiche separate per la routine e per le analisi urgenti); inoltre, la conoscenza del sospetto clinico permette anche di prevedere i valori di alcuni analiti, ed effettuare eventuali diluizioni del campione stesso;
2. l’indicazione dell’eventuale terapia in corso, poiché diversi farmaci possono creare interferenze analitiche con i metodi usati per il dosaggio, oppure possono alterare realmente i livelli ematici di un parametro di laboratorio;
3. la data e l’ora del prelievo; infatti, per numerosi analiti si possono verificare delle variazioni dei livelli in diverse ore della giornata, in base alla presenza di ritmi circadiani;
4. il tipo di indagine da eseguire (prelievo basale, prova da carico, prova funzionale, prova circadiana).

Le etichette applicate alle provette devono essere del tipo inasportabile e devono riportare le indicazioni necessarie all’identificazione univoca del paziente e dell’esame richiesto. In molti laboratori si iniziano ad utilizzare sistemi di identificazione mediante codice a barre, per ridurre gli errori; inoltre, le linee guida internazionali oggi indicano la necessità di usare un doppio codice di indentificazione (es. nome e data di nascita, oppure codice fiscale) perché, soprattutto nel caso di indagini di biologia molecolare clinica può capitare che nella stessa giornata vengano analizzati campioni appartenenti a diversi membri di una famiglia con lo stesso nome.

Standardizzazione del prelievo venoso

La standardizzazione dei metodi di raccolta e di pre-trattamento dei campioni biologici è una delle fasi più importanti e delicate dell’intero processo analitico, in quanto preservare le peculiarità chimiche, biologiche e morfologiche del campione stesso contribuisce al buon esito dell’analisi di laboratorio.

Errori di campionamento rientrano nella cosidetta variabilità pre-analitica (che comprende la modalità di prelievo, il trasporto, l’accettazione, trattamenti preliminari e la conservazione).

Al fine di ridurre errori in fase pre-analitica è importante che siano seguiti alcuni accorgimenti in fase di raccolta del campione, sia da parte dell’operatore che da parte del paziente che si sottopone al prelievo.

In primo luogo, la sede in cui si intende eseguire il prelievo (un vaso sanguigno facilmente accessibile) deve essere detersa e dinfettata con alcool al 70%, quindi fin quando la cute non è lesa ci si trova in condizioni di sterilità, per questo bisogna utilizzare strumenti sterili (ad es. provette ed aghi monouso) e chimicamente inerti (ad es. provette di vetro). Le provette sono chiuse con tappi di vario colore a seconda dei gruppi di esami da effettuare.

In secondo luogo, è noto che il prelievo va effettuato sul paziente riposato e a digiuno da almeno 6-8 ore, ma le condizioni che possono influenzare i risultati analitici sono molte, come ad esempio l’alimentazione, la postura, l’attività fisica e i ritmi cronobiologici, oltre che l’azione farmacologica e metabolica di alcuni medicamenti.

È importante quindi, che il paziente sia ben informato dal madico su alcune importanti prescrizioni da seguire prima di sottoporsi al prelievo (preparazione del paziente).

Digiuno

Gli effetti del digiuno sui risultati delle analisi di biochimica clinica sono molto importanti.

Infatti, bisogna ricordare che in fase post-prandiale i livelli di molti analiti nel siero aumentano, e possono quindi condurre ad errori diagnostici. Ad esempio, nelle 2-3 ore successive al pasto, la glicemia aumenta (infatti è possibile valutare la tolleranza al glucosio in fase post-prandiale), mentre la potassiemia e la fosforemia diminuiscono (a causa dei processi metabolici di utilizzazione del glucosio).

Analogamente, dopo un pasto i livelli di trigliceridi ematici aumentano, e rientrano nei valori di base 4-5 ore dopo il pasto.

A parte la variazione sui livelli ematici di molti parametri influenzati dal pasto, il digiuno è necessario per non alterare la lipemia, in quanto i sieri lipemici (cioè che contengono elevati livelli di trigliceridi) possono interferire con alcune metodiche analitiche, ad esempio con i metodi colorimetricio-spettrofotometrici diretti che non prevedono una preliminare precipitazione delle proteine.

Comunque, tranne in casi particolari, non è necessario che il digiuno superi le 8 ore.

Nello stesso tempo, infatti, il digiuno non deve essere troppo protratto, poiché anche il digiuno troppo protratto causa alterazioni dei parametri di laboratorio, come ad esempio un aumento dei livelli ematici di bilirubina, oppure un aumento degli acidi grassi circolanti (mobilizzati dalle riserve del tessuto adiposo).

Ovviamente vi sono casi in cui il digiuno di 8 ore non può essere osservato, ad esempio bambini piccoli, oppure pazienti ricoverati in pronto soccorso cui è necessario effettuare esami d’urgenza. In questi casi è bene ricordare quali sono i parametri di laboratorio influenzati dal pasto.

Alimentazione

Oltre al digiuno di 8 ore, anche l’alimentazione dei giorni precedenti il prelievo è importante.

Le principali prescrizioni dietetiche da seguire riguardano l’apporto glucidico, per i pazienti che devono essere sottoposti alla prova di tolleranza al carico glucidico. Questa indagine deve essere necessariamente programmata, in quanto nei giorni che precedono la prova il paziente deve assumere quantità equilibrate di glucidi.

Anche l’apporto lipidico deve essere controllato, in quanto la concentrazione di trigliceridi è inflenzata da variazioni dietetiche dei giorni che precedono il prelievo.

Viceversa, l’apporto proteico non è molto rilevante, in quanto in soggetti sani l’azotemia non aumenta in relazione al carico proteico dei giorni immediatamente precedenti il prelievo.

Infine, per la determinazione del metabolismo basale (che pur essendo caduta un po’ in disuso come valutazione di laboratorio viene ancora richiesta in alcuni centri), il paziente deve sottoporsi ad un regime di restrizione proteica per almeno tre giorni.

Inoltre, alcuni alimenti interferiscono con la determinazione di specifici analiti, ad esempio:

• I tiocianati (es., la senape) o composti simili al tiouracile interferiscono con il metabolismo degli ormoni tiroidei, riducendone la concentrazione ematica;
• Notevoli quantità di serotonina, ad esempio quelle contenute nelle banane e nell’ananas fresco, aumentano il tasso di acido 5-idrossiindolacetico escreto con le urine in maniera così rilevante da far sospettare un tumore carcinoide;
• La determinazione urinaria di aldosterone può essere influenzata da una dieta ricca di agrumi, caffè, carote e spinaci.

Postura ed attività fisica

Postura

Riposo a letto e postura influenzano la concentrazione di numerose sostanze nei liquidi biologici: questo è determinante per la valutazione dei dati di laboratorio dei pazienti ambulatoriali e degenti.

Ad esempio, in ortostatismo la concentrazione ematica di quasi tutti i parametri biochimico-clinici è più elevata a causa della modificazione nella distribuzione dei liquidi biologici; infatti, il volume plasmatico diminuisce del 10%, mentre il liquido interstiziale aumenta. Questo è il motivo per cui nei pazienti ambulatoriali risultano PIU`ELEVATI i valori di emoglobina, proteine totali e sostanze legate a proteine (es., calcio, colesterolo, bilirubina).

In gravidanza, a causa delle variazioni nel flusso plasmatico renale, si riscontra aumento dell’escrezione urinaria degli estrogeni in clinostatismo e della noradrenalina in ortostatismo.

Postura ed attività fisica (segue)

Attività fisica

Il prelievo deve essere eseguito al mattino, in condizioni di riposo in quanto l’attività fisica intensa può influenzare alcuni analiti, come gli enzimi localizzati prevalentemente nella muscolatura scheletrica: creatin chinasi (CK), aspartato aminotransferasi (AST), aldolasi, lattatodeidrogenasi (LD). Anche altri parametri biochimico-clinici aumentano nel siero con l’esercizio fisico, ad esempio l’ ammoniaca, l’acido lattico e l’acido piruvico; inoltre, dopo esercizio fisico prolungato sono stati riscontrati elevati valori di catecolamine urinarie.

D’altro canto, l’immobilizzazione completa protratta a lungo, determina un processo di demineralizzazione del tessuto scheletrico con aumento dell’escrezione urinaria del calcio, del fosforo e della idrossiprolina.

In conclusione possiamo dire che, in occasione del prelievo, è opportuno giungere riposati, senza aver compiuto intensa attività fisica nelle ore (meglio nelle due-tre settimane) precedenti il prelievo. Anche in questo caso, è importante segnalare al laboratorio di aver svolto una attività fisica intensa se non è possibile rimandare il prelievo.

Ritmi cronobiologici

Molti parametri di laboratorio sono influenzati direttamente o indirettamente dai ritmi cronobiologici. Ad esempio, la VES, i livelli di ACTH, del cortisolo, delle gonadotropine, della sideremia, della cloruremia, della calcemia, della 5-idrossitriptamina, l’escrezione urinaria di catecolamine, sodio, potassio e fosfati presentano variazioni cronobiologiche.

Queste variazioni di concentrazione ritmica possono presentarsi per periodi inferiori alle 24 h (ritmo ultradiano) o per periodi più lunghi, oltre le 24h (ritmo infradiano). Fra i ritmi infradiani si possono ricordare quelli di circa 7 giorni, quelli d un mese e quelli un anno.

Il ritmo più comune è quello circadiano, che ha come sincronizzatore più comune l’alternanza luce-oscurità, sonno-veglia, assunzione di cibo, oscillazioni nei livelli di alcuni ormoni trofici come l’ACTH.

Ad esempio, sono state riscontrate variazioni della sideremia fino al 50% nelle 24 ore. In particolare, il picco è al mattino fra le 8,00 e le 10,00 e valori più bassi nel tardo pomeriggio. Inoltre, è stato riscontrato che nei soggetti che lavorano durante la notte i valori più elevati sono spostati nelle ore pomeridiane, in fase col ciclo sonno-attività, per cui il ritmo appare invertito.

Ritmi cronobiologici (segue)

Allo stesso modo, i livelli di ACTH variano nelle diverse ore del giorno, e di conseguenza anche i livelli degli ormoni corticosteroidei (che sono controllati dall’ACTH) variano nel corso della giornata. Anzi, in alcuni casi proprio per valutare il funzionamento di questo ritmo, viene richiesto il dosaggio del cortisono e dell’ACTH in diverse ore del giorno.

Invece, un tipico esempio di ritmo circamensile è quello mestrruale nelle donne; anche questo ritmo può influenzare alcuni parametri di laboratorio. Ad esempio, a seguito delle mestruazioni, per qualche giorno i livelli di emoglobina possono essere più bassi, oppure effettuando l’esame delle urine è possibile trovare una maggior quantità di emoglobina ed eritrociti nelle urine. Anche in questo caso, quindi, è buona regola informare il laboratorio se gli esami vengono effettuati nel periodo mestruale o nei giorni immediatamente successivi.

Assunzione di medicamenti

È importante che nelle ore precedenti il prelievo siano interrotti gli eventuali trattamenti farmacologici a cui il paziente è stato sottoposto, in quanto alcuni farmaci o loro metaboliti possono interferire sui risultati delle analisi di laboratorio. In alternativa, l’assunzione di farmaci deve assolutamente essere comunicata al laboratorio.

L’ interferenza sulla reazione analitica può essere di natura fisica o chimica ed è dovuta all’azione farmacologica, immunologica o tossicologica dei medicamenti.

L’interferenza chimica è la causa più diffusa ed anche più critica. Sono stati riscontrati meccanismi di interazione del farmaco con l’analita (ad esempio, l’eparina compete con l’albumina con il verde di bromocresolo, colorante impiegato per la misura dell’albumina), di interazione con i reagenti (ad esempio, L-dopa, metildopa, isoniazide, 6-mercaptopurina, acido ascorbico interferiscono sul dosaggio dell’acido urico, mentre l’acido ascorbico interferisce sulla determinazione del glucosio), e di interazione con la tecnica di misura (ad esempio, lo spironolattone interferisce nel dosaggio fluorimetrico del cortisolo).

Assunzione di medicamenti (segue)

Esempi di interferenza fisica sono:

1. la vit. A e la riboflavina che, contenendo pigmenti gialli che vengono assorbiti nel tratto intestinale, possono alterare la misura della bilirubina eseguita con metodo diretto;
2. i preparati di eparina che contengono sodio bisulfito riducono il picco di assorbimento del verde di indocianina usato per la prova di cromosecrezione o di diluizione arteriosa.

Naturalmente, non devono essere sospesi i farmaci che sono stati prescritti dal medico per ottenere un effetto metabolico specifico (ad esempio la somministrazione di insulina o dell’allopurinolo), in quanto la modificazione indotta sul dato di laboratorio è attesa dal medico curante e come tale giustamente interpretata.

Tipi di campione: sangue intero, plasma o siero

Per le indagini biochimico cliniche si può utilizzare siero o plasma; il plasma si ottiene per centrifugazione da un campione disangue intero a cui è stato aggiunto un anticoagulante (per esempio, citrato, eparina) immediatamente dopo il prelievo. Il plasma può essere congelato per successive analisi.

Il siero ha una composizione simile a quella del plasma, ma non contiene alcuni fattori della coagulazione, poichè si ottiene lasciando coagulare il campione di sangue prima della centrifugazione. Per i test della coagulazione tutti i fattori coinvolti nella coagulazione devono essere preservati, quindi il siero non può essere utilizzato.

Bisogna sottolineare che rispetto al siero, il plasma ha minor rischio di emolisi.

Anticoagulanti

L’impiego di anticoagulanti è indispensabile per la misura dei fattori della coagulazione nel plasma e per tutte le analisi su sangue intero, come l’esame emocromocitometrico e la velocità di eritrosedimentazione (VES). I più diffusi anticoagulanti sono: eparina, EDTA, citrato di sodio ed ossalato. Ciascuno di essi ha delle indicazioni ma anche delle controindicazioni.

Eparina: mucopolisaccaride acido, in commercio come sale di litio, di sodio o di potassio. E’ considerato l’anticoagulante naturale, in quanto è presente a bassi livelli nel sangue e nei tessuti. Agisce inibendo la trombina, in associazione con l’antitrombina III, e altri fattori della coagulazione.

• Altera la morfologia e la colorazione dei leucociti.
• Provoca aggregazione delle piastrine.

EDTA (acido etilendiaminotetracetico): Esplica la sua azione anticoagulante sequestrando lo ione calcio, formando con esso dei sali insolubili. Rappresenta l’anticoagulante di scelta per l’esame emocitometrico. E’, infatti, il migliore per studiare la morfologia delle cellule del sangue.

• Non altera il volume degli eritrociti.
• Non provoca emolisi.
• Riduce al minimo la lisi dei leucociti.
• Limita l’aggregazione piastrinica.
• E’ rapidamente solubile nel sangue.

Anticoagulanti (segue)

Un eccesso di EDTA provoca il raggrinzimento degli eritrociti.

Citrato di sodio: impiegato per la misura della VES, per lo studio dei fattori della coagulazione e della funzionalità piastrinica. Esplica la sua azione anticoagulante come l’EDTA.

Ossalato: sale di sodio, potassio o ammonio. È l’anticoagulante chelante del calcio usato più raramente. Può essere usato per le analisi emocoagulative in alternativa al citrato.

Nella prossima diapositiva è mostrato uno schema delle provette più usate in biochimica clinica.

Identificazione delle provette