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Giuseppe Castaldo » 18.Diagnostica di laboratorio del diabete


Il pancreas endocrino

Il pancreas endocrino, deputato alla produzione di ormoni, comprende 4 tipi di cellule:

  • Cellule A o alfa (20%):  producono glucagone
  • Cellule B o beta (75%):  producono insulina
  • Cellule D o delta (5%):  producono somatostatina
  • Cellule F o PP (meno del 2%):  producono altre sostanze

La patologia più frequente del pancreas endocrino è il diabete.

La diagnosi di diabete si avvale del più comune test di laboratorio: la glicemia.

Glicemia

Campione biologico: plasma, siero, sangue intero. A parità di volume, gli eritrociti contengono meno glucosio rispetto al siero. Quindi, nel sangue intero la glicemia è più bassa rispetto al siero di circa il 10.

Inoltre, nel sangue venoso la glicemia è più bassa del 5-10% rispetto al sangue arterioso.

Per effettuare la glicemia occorre separare presto il plasma o il siero, perché gli eritrociti consumano glucosio, quindi diminuiscono la glicemia (circa 6 mg/dL/h).

Ideale: utilizzare fluoruro come anticoagulante (poiché inibisce la glicolisi, e quindi limita il consumo di glucosio da parte degli eritrociti).

Metodiche di dosaggio: enzimatiche.

Self-monitoring: (metodiche colorimetriche ed amperometriche).

Metodi per la glicemia

Metodiche di dosaggio del glucosio

  • Esochinasi: metodo di riferimento
    Glu + ATP > Glu-6P + ADP
    Glu-6P + NADP > 6P-gluconato + NADPH
  • Glucosio deidrogenasi: (può subire l’interferenza dello xilosio)
    Glu + NAD > gluconolattone + NADH
    (meglio con aggiunta di mutorotasi)

In queste due reazioni, si valuta la variazione delle concentrazioni di NADH o NADPH spettrofotometricamente.

  • Glucosio ossidasi: (risente di interferenza da parte di sostanze riducenti, es. glutatione)

Glu+ O2 > Acido gluconico + H2O2
H2O2+ cromogeno ridotto > cromogeno ossidato + H2O

In quest’ultima reazione si valuta la variazione di concentrazione del cromogeno spettrofotometricamente.

Omeostasi del glucosio

Glicemia a digiuno: tra 70 e 100 mg/dL (su sangue venoso).

Glicemia post-prandiale: fino a 180 mg/dL, con ritorno al valore basale entro 2-4 ore (a 2 ore deve essere < 140 mg/dL) CV intra-individuale per la glicemia: 5 -15% Sintomi da iperglicemia compaiono per valori >230 mg/dL.

Valore critico (al di sopra del quale vi può essere rischio per le funzioni vitali): 480 mg/dL (il laboratorio deve tempestivamente darne comunicazione).

Sintomi da ipoglicemia compaiono per valori <50 mg/dL.

Valore critico < 46 mg/dL

Significato clinico

Le fluttuazioni intra-individuali nelle 24 ore sono quelle più alte rispetto a tutti gli altri parametri del sangue (a causa di attività muscolare, introduzione di cibo).

Standardizzare l’ora del prelievo ed il tipo di campione biologico (digiuno da 8 h, plasma separato entro 1 h, eparina + NaF).

Il valore soglia per il sospetto di diabete corrisponde oggi a valori di glicemia >126mg/dL.

Diabete Mellito

Incidenza = 5-10 % negli adulti > 40 anni

Diabete di tipo 1 = distruzione delle beta cellule, con perdita della secrezione di insulina
- Immuno-mediato (auto-anticorpi), giovanile e dell’adulto;
- idiopatico.

Diabete di tipo 2
- Prevalente insulino-resistenza e relativo deficit di insulina
- Prevalente deficit di insulina e relativa insulino-resistenza

Diabete di altro tipo = farmaci, sostanze chimiche, difetti genetici

Diabete mellito gestazionale

IGT = impaired glucose tolerance

IFG = impaired fasting glucose (glicemia a digiuno compresa tra 100 e 126)

NB = I pazienti IGT e/o IFG devono essere ricontrollati ogni anno

Glicemia a digiuno

  • Soggetto normale    70-100 mg/dL
  • Diabete    > 126 mg/dL
  • IFG e IGT    100-125 mg/dL

Criteri per la diagnosi di Diabete ADA 2006

Sintomi legati al diabete (poliuria, polidispia ed inspiegabile perdita di peso) e rilievo casuale di glicemia plasmatica >200 mg/dl (Casuale significa in qualsiasi momento indipendentemente dalla distanza dall’ultimo pasto).
oppure
Glicemia plasmatica a digiuno (FPG) >126 mg/dl
(A digiuno significa distanza >8 ore dall’ultima ingestione di cibo o bevande caloriche).
Un valore di iperglicemia che non soddisfa i criteri diagnostici per il diabete deve essere rivalutato con un carico orale di glucosio (OGTT).
OGTT: test di tolleranza al glucosio per via orale
Somministrare 75 g di glucosio anidro in 250-300 mL di acqua in 5 minuti.

Criteri ADA 2006:

Glicemia a digiuno:     meno di 100 mg/dL

Glicemia a due ore dal pasto:     meno di 140 mg/dL

IFG      tra 100 e 125 mg/dL

Sospetto di Diabete      ≥ 126 mg/dL

Screening per il diabete

Storia familiare di diabete;

Obesità (BMI>30);

Ipertensione;

Iperlipidemia;

Storia precedente di diabete gestazionale;

Precedente IGT e/o IFG;

Razza (asiatica, afrocaraibica);

Età (>45 anni).

GDM (diabete mellito gestazionale)

Fattori di rischio anamnestici maggiori

  • Pregresso GDM
  • Familiarità di 1° grado
  • BMI ≥ 28
  • Pregressa macrosomia fetale (≥ 4 kg)
  • Mortalità perinatale da causa incerta

Fattori di rischio anamnestici minori

  • Sovrappeso
  • Ipertensione arteriosa
  • 2 o più aborti spontanei
  • Poliidramnios
  • Gestosi
  • Elevata parità
  • Parti pretermine

GDM (diabete mellito gestazionale) (segue)

Criteri diagnostici

  • Glicemia casuale ≥ 200 mg/dL o glicemia a digiuno ≥ 126 mg/dL;
  • In presenza di fattori di rischio eseguire alla 24ma settimana di gravidanza il test diagnostico (OGTT, con 100 g di glucosio anidro e valutazione della glicemia a 2h –VR < 155 mg/dL, a 3 h- VR < 140 mg/dL);
  • Negli altri casi, eseguire alla 24ma settimana il test di screening (minicarico di glucosio: 50 g di glucosio e valutazione della gli. ad 1h –VR < 140 mg/dL);
  • Ricontrollare e riclassificare la paziente GDM a 6 settimane dal parto = le IGT e/o IFG devono essere ricontrollate ogni anno, quelle normali dopo 3 anni.

Emoglobina glicosilata

L’emoglobina glicosilata è un test utile al monitoraggio del soggetto diabetico durante la terapia e alla valutazione del metabolismo glicidico nei due mesi precedenti il prelievo.

L’emoglobina glicosilata HbA1c è un addotto stabile del glucosio ai gruppi N-terminale delle catene beta dell’HbA.

Metodo di riferimento IFCC: spettrometria di massa o elettroforesi capillare.

Intervallo di riferimento HbA1c = 4,3 – 5,9 % dell’emoglobina totale.

< 6,3% = ottimo controllo glicemic.

> 9% = pessimo controllo glicemico.

Metodiche routinarie = cromatografia di affinità, HPLC, immunochimica.

Interferenze = emoglobinopatie e ridotta sopravvivenza della vita media dei G.R., emoglobine carbamilate.

Test per il controllo glicemico a breve termine

Albumina glicosilata;

Fibrinogeno glicosilato;

Fruttosamine (prodotto chetoiminico della glicazione proteica).

Insulina

Ormone peptidico (51 AA, PM = 5807 Da);
Pre-pro-insulina (110 AA);
Pro-insulina (86 AA);
Liberazione del peptide C con formazione di 2 catene (a = 30 AA + b = 21 AA), legate da 2 ponti disolfuro);
Esocitosi = 90% insulina + peptide C; 10% pro-insulina (la quota di pro-insulina aumenta nell’anziano, nel GDM, nel diabete dell’obeso, nell’insulinoma);
Il peptide C è secreto in quantità equimolari rispetto all’insulina, ma ha una concentrazione sierica 5-15 volte maggiori, perché non viene estratto dal fegato;
Metodo di determinazione:Immunometrico (AC monoclonali no cross reattivi con pro-insulina ne’ peptide C);
Valori di riferimento = 6-100 mU/L;
Test funzionali = TTGV = somministrare per ev 0,5mg/kg glucosio e misurare l’insulina in fase 1 (1-3-5-10 min): la somma dell’insulina ad 1 e a 3 min è > 100 mU/L in condizioni normali.

Autoanticorpi anti-insula

Non sono patogenetici (il danno alle beta cellule è mediato dai linfociti T), ma sono l’unico marcatore sierologico disponibile per valutare un danno alle cellule beta;

Nel diabete di tipo 1A compaiono in circolo già in fase pre-diabetica.

Esistono vari tipi di anticorpi:

  • ICA = Islet cell auto-AC
  • GADA = glutamic acid decarboxylase auto-AC
  • IAA e IA-A2= insulin auto-AC

Metodo di dosaggio = RIA

Interpretare la positività ed il titolo:

  • Scarso significato se positivo 1 e/o a basso titolo
  • Rischio del 50% se positivi 2 o 3 AC
  • Rischio dell’80% se positivi 4 AC

Sintesi dei corpi chetonici

A seguito del processo di beta ossidazione nel fegato possono formarsi quantità di acetil-CoA in eccesso rispetto alle capacità di smaltimento del ciclo di Krebs; in queste condizioni l’acetil-CoA viene utilizzato nel mitocondrio per la sintesi dei corpi chetonici (acetoacetato, b-idrossibutirato ed acetone).

I corpi chetonici sono utilizzati dai tessuti extraepatici convertendo il b-idrossibutirato in acetoacetato e l’acetoacetato in acetoacetilCoA.

Il fegato non possiede la acetoacetato:succinil-CoA transferasi, quindi l’utilizzazione come fonte energetica è solo extra-epatica. In condizioni normali l’acetone è quasi assente, l’acetoacetato e l’idrossibutirrato sono in rapporto di 1:1. Nella chetoacidosi questo rapporto aumenta fino a 3 – 6:1

Pochi corpi chetonici sono prodotti in condizioni di normale dieta. Se la dieta è povera di carboidrati, il fegato produce corpi chetonici utilizzando l’acetil-CoA derivato dalla ossidazione degli acidi grassi. Livelli maggiori di corpi chetonici sono prodotti durante il digiuno prolungato.

Chetoacidosi diabetica: Nel soggetto diabetico la  bassa concentrazione di glucosio nelle cellule fa si che il fegato produca molti corpi chetonici > acidosi.

La chetogenesi viene effettuata dal fegato quando si realizzano queste due condizioni:  1) disponibilità di acidi grassi per la beta-ossidazione; 2) carenza di glucosio.

Dosaggio dei corpi chetonici

Dosaggio urinario dei corpi chetonici
Generalmente l’acido aceto-acetico è dosato nelle urine mediante strisce reattive a base di nitroprussiato a pH 9 (metodo di Legal). Aggiungendo glicina si dosa anche l’acetone. In caso di positività le strisce si colorano in viola con un’intensità che varia a seconda della concentrazione dei corpi chetonici.

Limiti: dosaggio semiquantitativo, che non comprende anche il 3-β-idrossibutirrato, falsi positivi in presenza di farmaci contenenti gruppi sulfidrilici; falsi negativi se le strisce sono esposte all’aria o l’urina è molto acida.

Dosaggio sierico dei corpi chetonici

  1. Metodo enzimatico per il dosaggio dell’idrossibutirrato:
    • Idrossibutirrato + NAD > aceto-acetato + NADH
    • Metodo lineare tra 0 e 6 mM
  2. Metodo semiquantitativo su siero diluito 1:2

Dosaggio dei corpi chetonici (segue)

Valori di riferimento

  • In condizioni normali < 0,5 mM Iperchetonemia > 1 mM
  • Chetoacidosi > 3 mM
  • Iperchetonemia para-fisiologica:
    • Neonati
    • Gravidanza
    • Bambini con febbre e vomito

I materiali di supporto della lezione

Gaw. A. Biochimica Clinica, Milano, Elsevier Masson, 2007

L. Spandrio, Biochimica Clinica, Sorbona, 2000

L. Sacchetti, Medicina di laboratorio e diagnostica genetica, Sorbona, 2007

G. Federici, Medicina di laboratorio, Milano, Mc Graw Hill, 2008

Zatti, Medicina di laboratorio, Napoli, Idelson-Gnocchi, 2006

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