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Giuseppe Castaldo » 16.Il laboratorio nell'infiammazione


Infiammazione

Qualsiasi stimolo che provoca un danno tissutale induce una reazione infiammatoria locale, dapprima, e che è seguita, poi, da un largo numero di reazioni sistemiche e metaboliche.

L’infiammazione rappresenta, pertanto, una risposta protettiva dei tessuti vascolarizzati, diretta contro determinanti non-self.

Esistono diversi tipi di reazioni infiammatorie, differenziabili in base a:

  • Agente scatenante;
  • Componenti reclutati nella difesa immunitaria;
  • Mediatori prodotti;
  • Cellule accumulate al sito della reazione.
I diversi tipi di reazioni infiammatorie

I diversi tipi di reazioni infiammatorie


Attivazione del complemento

Il complemento è costituito da una ventina di proteine circolanti capaci di interagire con le membrane biologiche e con specifici recettori situati sulla superficie di diversi tipi cellulari, hanno la capacità di opsonizzare i patogeni e di indurre una serie di reazioni infiammatorie che aiutano a combattere le infezioni.

Ci sono tre distinte vie attraverso cui il complemento può essere attivato sulla superficie dei patogeni: la via classica, la via MB-lectin (mannan-binding lectin) e la via alternativa.
Le tre vie convergono in una via finale comune che porta alla attivazione del complesso di attacco alla membrana o MAC (membrane attack complex) costituita da una struttura multiproteica lipofila a forma di poro che provoca la lisi cellulare.

Attivazione del complemento (via classica)

Attivazione del complemento (via classica)

Attivazione del complemento (via alternativa)

Attivazione del complemento (via alternativa)


Le citochine

Le citochine sono messaggeri solubili (in genere glicoproteine) prodotte sia da cellule immunitarie che non immunitarie.
Regolano il sistema immunitario, la crescita e la differenziazione cellulare e la risposta infiammatoria, agendo in maniera autocrina, paracrina ed endocrina.

Si classificano in:

  • interleuchine (IL)
  • interferoni (INF)
  • Fattori di necrosi tumorale (TNF)
  • Fattori di crescita (GF) e colony-stimulating factors (CSF)

Nell’infiammazione le citochine vengono prodotte dai macrofagi attivati e dalle cellule endoteliali. Esse agiscono come secondi mediatori e causano la sintesi di molecole di adesione, attivano le proteine della fase acuta, etc.

Le citochine essenziali per l’infiammazione sono IL1, IL6 e il TNFa.

Principali citochine coinvolte nell’infiammazione

Principali citochine coinvolte nell'infiammazione


I derivati dell’acido arachidonico e la chemiotassi

L’acido arachidonico è prodotto dai fosfolipidi di membrana per azione della fosfolipasi A.

I principali mediatori coinvolti nella chemiotassi sono:

  • C5a
  • Peptidi N-formilati
  • LCTB4
  • PAF

La chemiotassi si realizza secondo queste tre fasi

  1. Ferma adesione, mediante integrine (ICAM, VCAM), all’endotelio vascolare
  2. Migrazione attraverso i gap dell’endotelio
  3. Migrazione attraverso il tessuto secondo un gradiente chemiotassico
Sintesi e ruolo dei derivati dell’acido arachidonico

Sintesi e ruolo dei derivati dell'acido arachidonico

Richiamo di cellule nel focolaio infiammatorio

Richiamo di cellule nel focolaio infiammatorio


Risposte sistemiche

Le risposte sistemiche possono essere:

Attivate da IL1, IL6 e TNFa

  • Alterazione della temperatura corporea (mediante sintesi di PGE2);
  • Secrezione di ACTH;
  • Effetto sul sistema emopoietico: riduzione dell’eritropoiesi, aumentata produzione di neutrofili e trombociti.

Attivate da varie citochine

  • Attivazione epatica della risposta della fase acuta.
Sintomi clinici correlati alla risposta infiammatoria

Sintomi clinici correlati alla risposta infiammatoria


Risposta della fase acuta

La risposta della fase acuta provoca il cambio della concentrazione di un largo numero di proteine plasmatiche (alcune in aumento, altre in diminuzione).
Il quadro proteico elettroforetico (QPE) nella fase acuta sarà così modificato:

  • α1- globuline aumentano precocemente, per l’aumento di a1-antitripsina
  • α2-globuline aumentano subito dopo, per l’aumento di aptoglobina e ceruloplasmina
  • Raramente aumentano le β-globine, per l’aumento di PCR e fibrinogeno

Invece, l’albumina e la transferrina diminuiscono nalla fase acuta dell’infiammazione, in quanto, essendo di piccole dimensioni, la maggiore permeabilità indotta dalla flogosi ne induce il passaggio agli spazi extravascolari. Quindi sono definite “proteine negative” della fase acuta:

  • Albumina
  • Trans-tiretina
  • Alfa-fetoproteina
  • Transferrina
  • a2-glicoproteina
Le proteine sieriche nella fase acuta

Le proteine sieriche nella fase acuta


La diagnosi dell’infiammazione

La “fase acuta” può considerarsi una risposta fisiologica di protezione e comprende due fasi:

  1. Fase di deflusso (ebb-phase): è generalmente breve e corrisponde allo shock clinico, derivante da una ridotta perfusione del tessuto;
  2. Fase di flusso (flow-phase): può avere una durata di giorni o settimane. Il metabolismo è alterato per garantire che l’energia prodotta sia a disposizione del tessuto interessato, a scapito del muscolo e delle riserve di grasso.

Per la diagnosi dell’infiammazione si effettua:

  • Misurazione della temperatura corporea.
  • Conta dei globuli bianchi ed esame della formula, che permette di stabilire se l’ infiammazione è provocata da agenti batterici o virali, se si tratta di un processo infiammatorio cronico o di una reazione allergica.
  • Analisi delle proteine di fase acuta o di marcatori non proteici, come la VES o la PCR, può essere utile per monitorare il progredire della patologia o l’effetto della terapia.

Valore diagnostico dei test per la diagnosi di infiammazione

La diagnosi di laboratorio per la valutazione di un processo infiammatorio si basa principalemte:
1) Conta dei globuli bianchi ed esame della formula:

  • infiammazioni da agenti batterici: leucocitosi (> 15.000) con neutrofili > 80%
  • Infiammazioni da virus: WBC normali o poco aumentati, in genere linfocitosi
  • Infiammazioni croniche: WBC normali o poco aumentati
  • Reazioni allergiche o parassitosi: WBC normali o poco aumentati, eosinofilia

2) analisi delle proteine di fase acuta o di marcatori non proteici, come la VES o la PCR, può essere utile per monitorare il progredire della patologia o l’effetto della terapia.
La valutazione della Proteina C reattiva (PCR) nel siero, la cui concentrazione cambia molto rapidamente, può essere usata per il controllo giornaliero dell’infiammazione.
La valutazione della velocità di sedimentazione degli eritrociti (VES) dà una misura indiretta del fibrinogeno e delle immunoglobuline. La VES varia lentamente e viene utilizzata per seguire l’andamento del processo infiammatorio al passare delle settimane”.

Sensibilità e specificità dei marcatori dell’infiammazione

Sensibilità e specificità dei marcatori dell'infiammazione


VES (velocità di eritosedimentazione)

Nell’infiammazione la VES aumenta perché l’aumento delle a-globuline e\o delle immunoglobuline favorisce la formazione di macroaggregati con i globuli rossi, che, pertanto, sedimentano più velocemente.

E’ un indicatore molto sensibile della fase acuta (la VES aumenta dopo circa 24 h e diminuisce 6-8 giorni dopo la risoluzione della fase acuta).
E’ alterata anche in tutte le situazioni di aumento di Ig, e nelle disproteinemie.
Inoltre, nelle forme di natura non neoplastica l’aumento delle proteine di fase acuta è in genere brusco e limitato nel tempo. Il riscontro di una reazione di fase acuta che si protrae nel tempo depone fortemente per un processo neoplastico.

Metodica: sangue citratato, aspirato in una pipetta di vetro o plastica graduata fino a 200 mm.

La sedimentazione si legge dopo 1 ora
VN (dopo 1 h): < 20mm nelle donne, < 15mm nei maschi.

Variazioni della VES in diverse condizioni

Variazioni della VES in diverse condizioni


PCR (proteina C reattiva)

E’ la classica proteina della fase acuta, è costituita da 5 catene identiche = pentaxina, proteine leganti il calcio, con proprietà di difesa; infatti è capace di legarsi ad un elevato numero di sostanze, sia esogene che endogene e quindi di facilitare la loro rimozione dal circolo (opsonizzazione). La sua produzione è indotta durante l’infiammazione acuta e cronica (le endotossine batteriche sono i più potenti stimoli alla produzione di PCR), ma anche in alcune neoplasie (linfoma non-Hodgkin’s, Ca renale) e nelle malattie autoimmunitarie e da immunocomplessi.
V di Rif.: adulti e bambini = 0,06- 10 mg\L (mediana: 0,58 mg/L); neonati < 0,06 mg\L; bambini fino ad 1 mese < 1,6 mg\L. Metodica: immunonefelometria, immunoturbidimetria, (detection limit di almeno 5mg\L; ancora più basso se il dosaggio si esegue in un neonato).

Un aumento di PCR è sempre indice di patologia o di infiammazione acuta o cronica, malattia autoimmunitaria o da complessi immuni, necrosi tissutale e cancro; mentre valori normali non escludono la presenza di piccoli focolai infiammatori, oppure di LES, sclerosi sistemica progressiva, dermatomiosite e colite ulcerosa, in cui la risposta della fase acuta è minima. Il grado di aumento della PCR riflette la massa o l’attività del tessuto infiammato:

  • PCR tra 10 e 50 mg\L = leggera infiammazione, localizzata (cistite, gengivite), infezioni virali
  • PCR tra 50 e 100 mg\L =malattia più severa, infezioni da Gram+
  • PCR > 100 mg\L = infezione batterica da Gram-

Utilità clinica della valutazione della PCR

La valutazione della PCR è importante:

  • Per diagnosticare e/o monitorare un’infezione, quando le indagini microbiologiche sarebbero troppo lente (complicazioni infettive post-operatorie, terapia intensiva, neonatologia, infezioni per neutropenia da chemioterapici o post-trapianto, monitorare la risposta alla terapia antibiotica);
  • Per lo screening di un processo infiammatorio (infezioni, IMA, trombosi venose profonde, malattie reumatiche, neoplasie);
  • Per il monitoraggio delle malattie reumatiche;
  • Per la diagnosi differenziale di alcune patologie gastro-intestinali (colon irritabile da patologie organiche; colite ulcerosa da morbo di Crohn).

Amiloide sierica A (SAA)

Apolipoproteina (lega le HDL), prodotta come proteina della fase acuta (aumenta di 100-1000 volte).
Significato fisiologico non noto.
Metodo di determinazione: RIA, ELISA, immunonefelometria, immunoturbidimetria.
VN: < 10 mg\L.
Significato clinico: parametro sensibile, paragonabile alla PCR, per monitorare la fase acuta della risposta infiammatoria, soprattutto per distinguere meglio le risposte minime.
E’ un indice molto sensibile di rigetto di trapianto (soprattutto per il trapianto renale).

Neopterina

È sintetizzata nei macrofagi dal GTP ad opera della guanosina-trifosfato-cicloidrolasi, che è stimolata dall’interferone γ, prodotto soprattutto durante la risposta immunitaria mediata dai linfociti T. E’ un indice che valuta l’attivazione del sistema immunitario, migliore del dosaggio delle citochine.

Metodi di determinazione
HPLC per la determinazione sulle urine, in rapporto alla concentrazione della creatinina
ELISA per la determinazione sul siero.

Neopterina (segue)

Indicazioni e significato clinico
Determinazione dell’attività di malattie associate ad attivazione della risposta immune cellulare:

  • Infezioni virali (epatite virale, HIV: nell’80% dei casi la neopterina rimane elevata anche dopo la sieroconversione; ricomincia ad aumentare con il progredire della malattia)
  • Infezioni batteriche o parassitarie con localizzazione intra-cellulare (tubercolosi, malaria)
  • Diagnosi differenziale tra infezioni virali e batteriche
  • Malattie autoimmunitarie: la neopterina segue il decorso della malattia, con variazioni che riflettono l’attività della malattia

Valutazione prognostica e monitoraggio terapeutico:

  • Patologie neoplastiche (soprattutto ematologiche)
  • Infezioni (soprattutto HIV)
  • trapianti di organi solidi: un aumento di neopterina precede di 2-7 giorni la comparsa di complicanze infettive virali o di rigetto
  • trapianti di midollo osseo: l’aplasia midollare si associa a diminuzione dei livelli di neopterina, che comincia a ricomparire circa 7 giorni prima della ricostruzione ematologica. Nel caso di infezione virale o GVH (graft versus host) reaction, la neopterina aumenta considerevolmente.

Neopterina (segue)

Monitoraggio delle terapie immunomodulanti: interferone, interleuchine.
Test di screening per escludere patologie nel sangue utilizzato per le trasfusioni.

I materiali di supporto della lezione

Gaw. A. Biochimica Clinica, Milano, Elsevier Masson, 2007

L. Spandrio, Biochimica Clinica, Sorbona, 2000

L. Sacchetti, Medicina di laboratorio e diagnostica genetica, Sorbona, 2007

G. Federici, Medicina di laboratorio, Milano, Mc Graw Hill, 2008

Zatti, Medicina di laboratorio, Napoli, Idelson-Gnocchi, 2006

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