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Maria Assunta Bevilacqua » 6.Ciclo di Krebs


Ciclo di Krebs

La lezione è della Prof. Paola Costanzo

I destini del piruvato

I destini del piruvato


Ciclo di Krebs (segue)

Il Ciclo dell’Acido Citrico detto anche degli Acidi Tricarbossilici o ciclo di Krebs è la via metabolica sulla quale convergono il metabolismo ossidativo dei carboidrati, degli acidi grassi e degli amminoacidi.

Questa via metabolica:

  • ha sede nei mitocondri;
  • è una via aerobica;
  • fornisce intermedi che sono precursori di numerose vie biosintetiche.

L’Acetil CoA necessario nella prima reazione del ciclo di Krebs deriva:

  • dalla beta ossidazione degli acidi grassi;
  • dalla deaminazione e ossidazione degli amminoacidi;
  • e dalla DECARBOSSILAZIONE OSSIDATIVA del piruvato che rappresenta il prodotto finale della glicolisi.
Principali precursori dell’Acetil CoA

Principali precursori dell'Acetil CoA

Origine e destini metabolici dell’acetilCoA

Origine e destini metabolici dell'acetilCoA


Ciclo di Krebs (segue)

Il piruvato attraversa la membrana mitocondriale interna grazie ad uno specifico trasportatore ed una volta giunto nella matrice viene convertito in Acetil CoA dal complesso multienzimatico della PIRUVATO DEIDROGENASI localizzato nel mitocondrio. Questa fase che precede il ciclo di Krebs:

- rappresenta una delle principali fonti di Acetil CoA;
- è una reazione IRREVERSIBILE;
- è una reazione che coinvolge 3 enzimi:

  • E1 (Decarbossilasi);
  • E2 (Diidrolipoil transacetilasi);
  • E3 ( diidrolipoil deidrogenasi).

- e coinvolge 5 coenzimi:

  • Tiamina pirofosfato(TPP);
  • acido lipoico;
  • Coenzima A;
  • FAD;
  • NAD+.
Tappe della reazione catalizzata dal complesso della piruvato deidrogenasi

Tappe della reazione catalizzata dal complesso della piruvato deidrogenasi


Ciclo di Krebs (segue)

CH3COCOOH+NAD+ + CoA  → CH3CO-SCoA+CO2+ NADH+H+
Piruvato                                           aceti-CoA

Enzima:  Piruvato deidrogenasi (E1) Coenzima: TPP

Enzima:  Diidrolipoil transacetilasi (E2) Coenzima: Acido Lipoico
Enzima:  Diidrolipoil deidrogenasi (E3) Coenzima: FAD

Reazione complessiva catalizzata dal complesso della piruvato deidrogenasi

Reazione complessiva catalizzata dal complesso della piruvato deidrogenasi


Ciclo di Krebs (segue)

Il coenzima A è un trasportatore di gruppi acilici.

I gruppi acilici formano legami tioestere con il gruppo tiolico del coenzima A.

L’acido lipoico è unito alla catena laterale di un residuo di lisina di E2 mediante un legame amidico.

Struttura del Coenzima A

Struttura del Coenzima A

Acido lipoico unito da un legame amidico alla catena laterale di un residuo di lisina

Acido lipoico unito da un legame amidico alla catena laterale di un residuo di lisina


Ciclo di Krebs (segue)

Tappe della DECARBOSSILZIONE OSSIDATIVA del piruvato ad acetil-CoA da parte del complesso della piruvato deidrogenasi.

Nella tappa 1 l’atomo C2 del piruvato reagisce con la TPP legata ad E1 andando incontro a decarbossilazione e formando un gruppo idrossietile.

Nella tappa 2 il gruppo idrossietilico viene ossidato a gruppo acetato, il gruppo lipoilico dell’E2 si riduce e si formano 2 gruppi sulfidrilici.

Nella tappa 3 l’acetato viene prima esterificato ad uno dei due gruppi sulfidrilici del gruppo lipoilico e poi transesterificato a CoA, formando acetil CoA.

Nelle tappe 4 e 5 si hanno una serie di trasferimenti di elettroni che servono a rigenerare la forma ossidata a disolfuro del gruppo lipoilico dell’E2.

Tappe della decarbossilazione ossidativa del piruvato ad acetil-CoA

Tappe della decarbossilazione ossidativa del piruvato ad acetil-CoA

Tappe della decarbossilazione ossidativa del piruvato ad acetil-CoA

Tappe della decarbossilazione ossidativa del piruvato ad acetil-CoA


Ciclo di Krebs (segue)

Regolazione del complesso della piruvato deidrogenasi

Regolazione covalente
Fosforilazione/defosforilazione di E1: la proteina chinasi fosforila E1 inibendola, mentre la fosfoproteina fosfatasi riattiva il complesso defosforilandolo.

Infatti fanno parte del complesso una chinasi e una fosfatasi. La chinasi è attivata allostericamente da ATP

Regolazione allosterica

  • Inibito dai prodotti della reazione: ATP, NADH e dell’Acetil-CoA;
  • attivato da AMP, CoA NAD+.

Quindi, il complesso della piruvato deidrogenasi viene inibito dalla presenza di segnali che indicano un elevato livello energetico.

Regolazione covalente del complesso della piruvato deidrogenasi

Regolazione covalente del complesso della piruvato deidrogenasi

Regolazione allosterica del complesso della piruvato deidrogenasi

Regolazione allosterica del complesso della piruvato deidrogenasi


Ciclo di Krebs (segue)

Il ciclo dell’acido citrico è costituito da otto reazioni che ossidano il gruppo acetile dell’AcetilCoA a 2 molecole di CO2, conservando l’energia libera in 3 NADH e 1 FADH2 e 1 GTP.

Il potere riducente prodotto verrà utilizzato nella catena di trasporto degli elettroni per produrre energia.

I prodotti di un giro del ciclo dell’acido citrico

I prodotti di un giro del ciclo dell'acido citrico


Ciclo di Krebs (segue)

Le tre fasi principali della respirazione cellulare

Le tre fasi principali della respirazione cellulare


Ciclo di Krebs (segue)

1° reazione - Formazione del Citrato

  • Reazione irreversibile.
  • L’atomo di carbonio metilico del gruppo acetilico si lega al gruppo carbonilico dell’ossalacetato.
  • La grande variazione di segno negativo dell’energia libera è essenziale per la progressione del ciclo, a causa delle basse concentrazioni di ossalacetato presenti nella cellula.
  • Il CoA libero formato dalla reazione viene riciclato ed è disponibile per la decarbossilazione ossidativa di un’ altra molecola di piruvato.

CITRATO SINTASI
E’ un enzima omodimerico.
Ogni subunità è una singola catena polipeptidica.

Adattamento indotto: il legame dell’ossalacetato (giallo) induce un significativo cambio conformazionale, che crea il sito di legame per il secondo substrato, l’acetilCoA.

Formazione del citrato catalizzata dalla citrato sintasi

Formazione del citrato catalizzata dalla citrato sintasi

Citrato sintasi. a) enzima da solo;b) forma chiusa dopo aver legato l’ossalacetato

Citrato sintasi. a) enzima da solo;b) forma chiusa dopo aver legato l'ossalacetato


Ciclo di Krebs (segue)

2° reazione - Isomerizzazione del citrato a isocitrato

Reazione reversibile spinta a destra dalla rimozione dell’isocitrato da parte della tappa successiva.

ACONITASI
Contiene un centro ferro-zolfo che agisce nel legame del substrato al sito attivo e nella catalisi dell’aggiunta e rimozione della molecola di acqua.

3 atomi di ferro legano tre residui di cisteina dell’enzima e il quarto atomo di ferro è legato ad uno dei gruppi carbossilici del citrato.

Formazione dell’isocitrato attraverso il cis-aconitato catalizzata dall’aconitasi

Formazione dell'isocitrato attraverso il cis-aconitato catalizzata dall'aconitasi

Centro ferro-zolfo dell’aconitasi

Centro ferro-zolfo dell'aconitasi


Ciclo di Krebs (segue)

3° reazione - Formazione dell’α-chetoglutarato
(Prima decarbossilazione ossidativa)

Decarbossilazione ossidativa di isocitrato ad a-chetoglutarato .

Reazione irreversibile.

ISOCITRATO DEIDROGENASI
Esiste in due diverse forme: una richiede NAD+ come accettore di elettroni e un’altra utilizza NADP+.

Nelle cellule eucariotiche l’isozima NAD-dipendente è presente nella matrice mitocondriale e opera all’interno del ciclo dell’acido citrico per produrre a-chetoglutarato .

L’isozima NADP-dipendente è presente sia nella matrice mitocondriale che nel citosol e serve a produrre NADPH, coenzima essenziale delle biosintesi riduttive.

Ossidazione dell’isocitrato ad achetoglutarato e CO2 da parte dell’isocitrato deidrogenasi

Ossidazione dell'isocitrato ad achetoglutarato e CO2 da parte dell'isocitrato deidrogenasi


Ciclo di Krebs (segue)

4° reazione - Formazione del succinil-CoA
(Seconda decarbossilazione ossidativa)

Reazione irreversibile.

Decarbossilazione ossidativa catalizzata da un complesso multienzimatico molto simile a quello della piruvato deidrogenasi per struttura e funzione.

COMPLESSO DELL’ α-CHETOGLUTARATO DEIDROGENASI
Il complesso dell’a-chetoglutarato deidrogenasi è formato da:
Enzima: α-chetoglutarato deidrogenasi Coenzima: TPP
Enzima: diidrolipoil transuccinilasi Coenzima: Acido lipoico
Enzima: diidrolipoil deidrogenasi Coenzima: FAD

Il complesso non è regolato mediante meccanismo di fosforilazione/defosforilazione.

Ossidazione dell’α-chetoglutarato a succinil-CoA e CO2

Ossidazione dell'α-chetoglutarato a succinil-CoA e CO2


Ciclo di Krebs (segue)

5° reazione - Formazione del succinato
(Fosforilazione a livello del substrato)

Viene idrolizzato il legame tioestere a succinato e CoA.
Il legame tioestere ha energia libera di idrolisi fortemente negativa (-36kJ/mole).
L’energia viene utilizzata per favorire la sintesi di un legame fosfoanidridico sotto forma di GTP o ATP.

GTP + ADP  → ATP + GDP

Nucleoside difosfato chinasi

6° reazione - Formazione del fumarato
(Ossidazione FAD-dipendente)

SUCCINATO DEIDROGENASI
L’enzima è legato saldamente alla membrana interna dei mitocondri.
Contiene 3 centri ferro-zolfo e una molecola di FAD legata covalentemente.
Gli elettroni estratti dal succinato passano attaverso i centri ferro-zolfo e il FAD prima di entrare nella catena di trasporto di elettroni della membrana mitocondriale interna.

Conversione del succinil-CoA a succinato da parte della succinil-CoA sintetasi

Conversione del succinil-CoA a succinato da parte della succinil-CoA sintetasi

Ossidazione del succinato a fumarato ad opera della succinato deidrogenasi

Ossidazione del succinato a fumarato ad opera della succinato deidrogenasi


Ciclo di Krebs (segue)

Rappresentazione del flusso di elettroni e di protoni attraverso la catena respiratoria

Rappresentazione del flusso di elettroni e di protoni attraverso la catena respiratoria


Ciclo di Krebs (segue)

7° reazione - Formazione di L-malato
(Reazione di idratazione)

L’enzima è altamente stereospecifico e catalizza l’idratazione del doppio legame trans del fumarato.

Non agisce sul maleato, isomero cis del fumarato.

8° reazione - Formazione di ossalacetato
(Reazione di ossidazione)

La concentrazione di ossalacetato nella cellula è bassa (<10-6 M).

L’ossalacetato viene continuamente rimosso dalla reazione fortemente esoergonica della citrato sintasi.

Idratazione del fumarato per produrre malato ad opera della fumarasi

Idratazione del fumarato per produrre malato ad opera della fumarasi

Ossidazione del malato ad ossalacetato catalizzata dalla malato deidrogenasi

Ossidazione del malato ad ossalacetato catalizzata dalla malato deidrogenasi


Ciclo di Krebs (segue)

Ciclo di Krebs

Ciclo di Krebs


Ciclo di Krebs (segue)

BILANCIO ENERGETICO dell’ossidazione aerobica di 1 molecola di glucosio attraverso la glicolisi, la reazione della piruvato deidrogenasi, il ciclo di Krebs e la fosforilazione ossidativa:

  • 32 molecole di ATP nei reni, nel fegato e nel cuore;
  • 30 molecole ATP nel muscolo e nel cervello.

Il trasferimento di 2 elettroni dal NADH all’O2 produce circa 2.5 molecole di ATP.

Il trasferimento di 2 elettroni dal FADH2 all O2 produce circa 1.5 molecole di ATP.

Ciclo di Krebs (segue)

Regolazione del flusso di metaboliti dal piruvato nel ciclo di Krebs

Regolazione del flusso di metaboliti dal piruvato nel ciclo di Krebs


Ciclo di Krebs (segue)

Funzioni biosintetiche del ciclo di Krebs

Funzioni biosintetiche del ciclo di Krebs


Ciclo di Krebs (segue)

Ruolo del ciclo di Krebs nell’anabolismo

Ruolo del ciclo di Krebs nell'anabolismo


Ciclo di Krebs – Reazioni anaplerotiche


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