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Maria Assunta Bevilacqua » 2.Mioglobina ed emoglobina


Il Ligando

Le funzioni di molte proteine richiedono il legame con altre molecole: il Ligando:

  • è una molecola che si lega reversibilmente ad una proteina;
  • può essere qualsiasi tipo di molecola, anche una proteina;
  • l’interazione Proteina-Ligando dipende dalla struttura della proteina;
  • è reversibile;
  • si associa a modificazioni conformazionali che ne influenzano l’affinità e la specificità.

Interazione proteina – Ligando

Fig. 2.1

Fig. 2.1


Interazione proteina – Ligando (segue)

Il legame reversibile di un Ligando (L) ad una proteina (P) determina la formazione del complesso (PL)

P + L ↔PL

K{_a} = \frac {[PL]} {[P][L]}

\frac {K{_a}[L]} {P} = [PL]

Ka = Costante di associazione

  • Il rapporto tra proteina con Ligando Legato (PL ) e Proteina Libera (P) è direttamente proporzionale alla concentrazione di L;
  • Quando la concentrazione di L è molto alta rispetto ai siti di legame sulla proteina la quantità di PL resta costante;
  • Il legame reversibile di un Legame (L) ad una proteina (P) descrive una iperbole rettangolare.

Interazione proteina – Ligando (segue)

Fig. 2.2: in grafico i siti di legame sulla proteina occupata dal ligando rispetto alla concentrazione di Ligando (L)

Fig. 2.2: in grafico i siti di legame sulla proteina occupata dal ligando rispetto alla concentrazione di Ligando (L)


Interazione proteina – Ligando (segue)

1/Ka = Kd costante di dissociazione.

Il valore di concentrazione di Ligando a cui metà dei siti di legame sulla Proteina sono occupati dal Ligando

K{_d} = \frac{[P] [L]} {[PL]} PL = \frac {[P] [L]} {K{_d}}

Kd = esprime l’affinità di una proteina per il suo substrato.
Valore basso di Kd corrisponde a una elevata affinità della proteina per il Ligando e viceversa.

Interazione proteina – Ligando (segue)

Variazioni conformazionali provocate dall’interazione della proteina con uno o più Ligandi, fornisce l’attivazione (o inattivazione) necessaria per compiere la propria funzione biologica (o per impedirla).

Interazione tra un ligando (sfera bianca) ed una proteina

Interazione tra un ligando (sfera bianca) ed una proteina


Interazione proteina – Ligando (segue)

La complementarità geometrica e chimica fra piccole molecole biologiche (ligandi) e le strutture dei loro bersagli macromolecolari (recettori) gioca un ruolo molto importante all’interno dei processi biologici

La complementarità geometrica e chimica fra piccole molecole biologiche (ligandi) e le strutture dei loro bersagli macromolecolari (recettori) gioca un ruolo molto importante all'interno dei processi biologici


La mioglobina

La funzione della mioglobina dipende dalla sua capacità di legare l’ossigeno ma anche di rilasciarlo.

Struttura della mioglobina:

  • scheletro peptidico e gruppo eme;
  • le strutture elicoidali sono indicate con le lettere dalla A alla H.
Fig. 2.3: struttura della mioglobina

Fig. 2.3: struttura della mioglobina


Gruppo Eme

  • Il ferro ha 6 legami di coordinazione: 4 nel piano della porfirina impegnati con i 4 atomi di azoto e 2 perpendicolari al piano dell’eme;
  • Quinto sito di coordinazione: Istidina His F8.α;
  • Sesto sito di coordinazione: serve a legare l’ossigeno.
Fig. 2.4.1: gruppo EME

Fig. 2.4.1: gruppo EME

Fig. 2.4.2: i due legami di coordinazione perpendicolari al piano dell’eme

Fig. 2.4.2: i due legami di coordinazione perpendicolari al piano dell'eme


La mioglobina

Analisi del sito di legame per l’ossigeno della mioglobina

HisE7 detta istidina distale:

  • si trova vicino all’ossigeno;
  • non è legata al ferro ma forma un legame Idrogeno con l’ossigeno legato all’eme;
  • funziona come una porta che si apre e chiude;
  • l’ossigeno (Ligando) entra ed esce dalla tasca dell’eme (vedi figura);
  • la molecola non è rigida;
  • HisE7 funziona come una porta che si apre e chiude quando l’ossigeno entra nella tasca idrofobica per legarsi all’eme;
  • Il risultato è una rotazione della molecola intorno all’HisE7 ogni 10-9s.
Fig. 2.5: il sito di legame per l’ossigeno della mioglobina

Fig. 2.5: il sito di legame per l'ossigeno della mioglobina


La mioglobina (segue)

Fig. 2.6: curva di legame dell’ossigeno alla mioglobina

Fig. 2.6: curva di legame dell'ossigeno alla mioglobina


Proteine oligomeriche

  • Sono formate da più catene polipeptidiche;
  • Ciascuna catena è detta protomero o subunità;
  • Hanno struttura quaternaria.
  • La struttura quaternaria è stabilizzata da:
    • forze di Van der Waals;
    • legami idrogeno;
    • legami ionici.

L’emoglobina

Fig. 2.7: la struttura della Emoglobina: l’emoglobina è un tetramero formato da quattro catene polipeptidiche (due catene α e due catene β)

Fig. 2.7: la struttura della Emoglobina: l'emoglobina è un tetramero formato da quattro catene polipeptidiche (due catene α e due catene β)


L’emoglobina (segue)

L’emoglobina esiste in due conformazioni tesa (T) e rilassata (R).  Entrambe le conformazioni possono legare l’O2 ma con affinità diversa.
Il legame di O2 ad una subunità dell’Hb nello stato T innesca una modificazione conformazionale che viene trasmessa alle subunità adiacenti convertendo la molecola nello stato R.

Fig. 2.8: emoglobina

Fig. 2.8: emoglobina


L’emoglobina (segue)

Posizione dello ione ferro nella deossiemoglobina (stato T); è situato leggermente all’esterno del piano della porfirina dell’eme.
Il legame con l’ossigeno sposta il ferro nel piano dell’eme. L’istidina prossimale (His F8) si sposta con il ferro.

Fig. 2.9: emoglobina

Fig. 2.9: emoglobina


Legame dell’ossigeno all’emoglobina

L’emoglobina passa da uno stato a bassa affinità (T) ad uno stato ad alta affinità (R).
La prima molecola di ossigeno interagisce con la deossiemoglobina (stato T) e causa una modificazione conformazionale che viene comunicata alle subunità adiacenti.
Facilitando il legame con le altre molecole di O2, la transizione T —- R rende più facile il legame di una seconda molecola.
L’ultima (la 4a molecola di O2) si lega ad un gruppo eme di una subunità che è ormai nello stato R cioè di massima affinità per il suo ligando.

Fig. 2.10: l’emoglobina lega l’ossigeno in modo cooperativo

Fig. 2.10: l'emoglobina lega l'ossigeno in modo cooperativo


Differenze tra la mioglobina e l’emoglobina

La mioglobina per la sua struttura si adatta bene a molecola con la funzione di conservare l’Ossigeno (curva iperbolica non risente di piccole variazioni di concentrazione di ossigeno).

L’emoglobina è una proteina oligomerica:

  • per la sua struttura è sensibile a piccole variazioni di Ligando;
  • modula il suo legame con l’Ossigeno sulla base della richiesta a livello dei diversi tessuti.

Proteina allosterica

Una proteina allosterica contiene due o più siti di legame distinti che interagiscono in modo funzionale l’uno con l’altro.

Sono presenti almeno due siti in due differenti posizioni capaci di legare ligandi (substrati, recettori, …).
Il legame di un Ligando ad un sito può indurre cambiamenti nelle proprietà di un altro sito sulla stessa molecola proteica.

Il Ligando è anche detto modulatore con effetti di attivatore o inibitore.

  • Il modulatore è detto omotropo: normale ligando di una proteina allosterica;
  • Il modulatore è detto eterotropo: molecola diversa.

Il legame dell’ossigeno all’emogloblina è un esempio di regolazione allosterica omotropa.

Due differenti modelli per spiegare l’allosterismo

Sono stati ipotizzati due differenti modelli:

  1. modello simmetrio: tutte le subunità vanno incontro contemporaneamente alla transizione verso una forma o verso l’altra. Le due conformazioni sono in equilibrio fra loro;
  2. modello sequenziale: il legame del ligando induce una modificazione conformazionale nelle subunità adiacenti. La simmetria della proteina oligomerica non viene mantenuta. Ogni subunità può avere la forma inattiva o attiva, sono possibili molti intermedi conformazionali.
Fig. 2.11.1: modello simmetrico dell’allosterismo

Fig. 2.11.1: modello simmetrico dell'allosterismo

Fig. 2.11.2: modello sequenziale dell’allosterismo

Fig. 2.11.2: modello sequenziale dell'allosterismo


Effetto BOHR

L’effetto BOHR è l’effetto del pH  sul legame dell’Ossigeno all’Emoglobina.

La curva di saturazione dell’Ossigeno all’Hb è influenzata dalla concentrazione di ioni H+ secondo la seguente reazione:

HHb++ O2 ↔ HbO2 + H+

Lo ione H+ si lega principalmente alla:

Subunità beta —- His146 —- H+

I residui protonati formano una coppia ionica che stabilizza l’Hb nello Stato T della deossiemoglobina.

Effetto BOHR (segue)

Il legame dell’ossigeno all’emoglobina è influenzato da:

  • pH;
  • concentrazione di CO2.

L’emoglobina trasporta il 40% degli ioni H+ totali e il 15-20% della CO2 dai tessuti ai polmoni e ai reni.

L’ossidazione delle sostanze organiche comporta una diminuzione del pH nei tessuti quindi l’affinità dell’emoglobina per l’ossigeno diminuisce e viene favorito il rilascio di O2.

Come si osserva in figura a pH più bassi la curva di saturazione si sposta a destra ad indicare una minore affinità dell’Hb per l’ossigeno.
La mioglobina non è influenzata da variazioni di pH.

Fig. 2.12: la curva di saturazione dell’ossigeno per l’emoglobina a differenti valori di pH

Fig. 2.12: la curva di saturazione dell'ossigeno per l'emoglobina a differenti valori di pH


Trasporto della CO2

L’80% della CO2 viene trasportata nel plasma come ione bicarbonato e si lega al gruppo alfa-amminico (N-terminale) delle quattro catene:
R––NH2 + HCO3- <––––> R––NH-COO- + H+

  • Formazione di carbammati e rilascio di protoni che contribuiscono all’effetto Bohr;
  • La carica negativa favorisce la formazione dei ponti salini tra le catene alfa e beta, caratteristici della deossiemoglobina;
  • A livello polmonare, l’ossigenazione porta alla liberazione di H+ che spostano la reazione verso sinistra;
  • Lo ione bicarbonato liberato dal carbammato e quello trasportato dal plasma dai tessuti ai polmoni, in seguito ad acidificazione liberano CO2.
Fig. 2.13: l’effetto Bohr in generale. Nel tessuto in intensa attività metabolica l’emoglobina rilascia ossigeno e lega sia CO2 che H+. Nei polmoni l’emoglobina rilascia entrambi

Fig. 2.13: l'effetto Bohr in generale. Nel tessuto in intensa attività metabolica l'emoglobina rilascia ossigeno e lega sia CO2 che H+. Nei polmoni l'emoglobina rilascia entrambi


Il BPG si lega in un sito distante dal sito di legame dell’O2

  • Presente in quantità elevate nei globuli rossi;
  • Effettore allosterico “a lungo termine”.

Legame del BPG alla deossiemoglobina

  • Abbassa l’affinità di legame per l’ossigeno e stabilizza lo stato T.

Esempio di regolazione allosterica eterotropica

  • Regola l’affinità dell’Hb in relazione alla pO2 nei polmoni;
  • Adattamento fisiologico alla bassa pO2 ad elevata altitudine;
  • Abbassa l’affinità dell’ossigeno favorendone il rilascio nei tessuti periferici.

Legame del 2,3- bisfosfoglicerato

  • Il BPG è presente in quantità elevate nei globuli rossi e si lega in un sito distante dal sito di legame dell’O2;
  • Per la presenza di cariche negative nella sua struttura si lega alla deossiemoglobina, abbassa l’affinità di legame per l’ossigeno e la stabilizza nello stato T;
  • È un effettore allosterico “a lungo termine” poiché abbassa l’affinità dell’ossigeno favorendone il rilascio nei tessuti periferici.

Il BPG è un esempio di regolazione allosterica eterotropica.
Regola l’affinità dell’Hb in relazione alla pO2 nei polmoni. Quando un individuo si sposta dal livello del mare ad elevata altitudine la presenza del BPG determina il rilascio di ossigeno.  Il BPG è quindi responsabile dell’adattamento fisiologico alla bassa pO2.

Fig. 2.14.1

Fig. 2.14.1

Fig. 2.14.2: il BPG stabilizza lo stato T dell’emoglobina

Fig. 2.14.2: il BPG stabilizza lo stato T dell'emoglobina


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