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Vincenzo De Simone » 1.Sistemi di sequenziamento del DNA “high Throughput”


Strategia “classica” di sequenziamento di un genoma


I Sequenziatori di DNA attualmente più diffusi

I tre sequenziatori automatici di DNA attualmente più diffusi:
Sequenziatore “classico” a 96 capillari 9600 Applied Biosystems.
Sequenziatore di II generazione 454 GS Roche.
Sequenziatore di II generazione Illumina/Solexa

I tre sequenziatori automatici di DNA attualmente più diffusi: Sequenziatore "classico" a 96 capillari 9600 Applied Biosystems. Sequenziatore di II generazione 454 GS Roche. Sequenziatore di II generazione Illumina/Solexa


Il sequenziatore 454-Roche

Questo filmato introduttivo mostra le caratteristiche generali del sequenziatore 454-Roche e riassume i punti fondamentali delle quattro tappe della procedura di sequenziamento di un genoma.

Il sequenziatore 454-Roche


454 – Preparazione del DNA da sequenziare

Il filmato illustra la prima tappa della procedura di sequenziamento, nella quale il DNA del genoma da sequenziare è frammentato per nebulizazione. Ai frammenti vengono attaccate sequenze terminali complementari ai “primers” utilizzati nella successiva fase di amplificazione in emulsione (emPCR).

454 – Preparazione del DNA da sequenziare


454 – La PCR in emulsione (emPCR)

Il filmato illustra la seconda tappa della procedura di sequenziamento: i frammenti di DNA da sequenziare sono amplificati singolarmente con una tecnica detta PCR in emulsione (emPCR).

454 – La PCR in emulsione (emPCR)

 


454 – Il pirosequenziamento

Il filmato illustra la terza tappa della procedura di sequenziamento, nella quale i frammenti di DNA amplificati, isolati in microcelle, sono sottoposti a piro-sequenziamento mediante l’azione combinata di tre enzimi: una DNA polimerasi (sintesi di DNA e rilascio di P-P), una solforilasi (idrolizza il P-P producendo ATP) e una luciferasi (idrolizza l’ATP emettendo un lampo luminoso).

454 – Il pirosequenziamento


454 – Lettura delle sequenze di DNA

Il filmato illustra la quarta tappa della procedura di sequenziamento: ad ogni iniezione di nucleotidi le fibre ottiche associate alle celle trasmettono alla videocamera il segnale luminoso generato dall’incorporazione. Dopo un passaggio di normalizzazione, il segnale luminoso emesso da ogni cella viene quantizzato, e i dati relativi a ciascuna cella sono convertiti in una successione di caratteri alfanumerici (sequenza di DNA).

454 – Lettura delle sequenze di DNA


454 – Alcune applicazioni

Il filmato illustra tre applicazioni del sequenziatore “high-throughput” 454-Roche:

  1. Assemblaggio di “contigs” nel sequenziamento di genomi ex novo.
  2. Confronto di sequenze con un genoma di riferimento noto (risequenziamento).
  3. Sequenziamento di specifici “ampliconi” per la ricerca di mutazioni o di varianti.

454 – Alcune applicazioni


454 – Analisi del Transcrittoma

Un’applicazione del sequenziatore 454 Roche è l’analisi del trascrittoma. L’RNA da analizzare, retrotrascritto in cDNA, è sequenziato con la procedura descritta. Le sequenze dei cDNA sono allineate alla sequenza del genoma. Sono possibili analisi qualitative e quantitative.


Il sequenziatore di DNA Illumina/Solexa – I


Il sequenziatore di DNA Illumina/Solexa – II


Il sequenziatore di DNA Illumina/Solexa – III


Il sequenziatore di DNA Illumina/Solexa – IV


Il sequenziatore di DNA Illumina/Solexa in azione

Il filmato mostra un sequenziatore di DNA Illumina/Solexa in azione.

Il sequenziatore di DNA Illumina/Solexa in azione


Sequenziatori di III generazione (single-molecule)

Due strategie per il sequenziamento di molecole singole di DNA:

  • Sequenziamento per degradazione progressiva con una esonucleasi di DNA fluorescente. Ciascuna base porta un fluorocromo diverso .
  • Sequenziamento per incorporazione di nucleotidi fluorescenti. Ad ogni passaggio, subito dopo l’acquisizione dell’immagine il fluorocromo dell’ultima base è inattivato.

Sequenziatori Helicos (single molecule sequencing)

Ciclo di sequenziamento del sequenziatori Helicos con tecnologia
“True Single Molecule Sequencing” (tSMS)


Sequenziatori Helicos – II

Immagine ottenuta durante il sequenziamento con apparecchiatura Helicos. Il “blow-up a destra mostra il segnale generato da tre molecole singole di DNA.


Sequenziatori Helicos – III

Il filmato illustra le caratteristiche di funzionamento di un sequenziatore Helicos con tecnologia “True Single Molecule Sequencing” (tSMS)


Helicos True Single Molecule Sequencing – IV

Quadro di raffronto delle caratteristiche dei sequenziatori di DNA di I, II e III generazione.

Helicos True Single Molecule Sequencing – IV


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