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Vincenzo De Simone » 6.La Replicazione del DNA


II-C) Utilizzo in laboratorio degli enzimi della replicazione

Marcatura del DNA, sequenziamento, PCR

Prof. Vincenzo De Simone

Dott.ssa Luisa De Magistris

Marcatura del DNA mediante “nick-translation”


Marcatura terminale del DNA mediante “fill-in”


Marcatura terminale del DNA con la DNA chinasi


Elettroforesi e sequenziamento del DNA


Caratteristiche comuni dei metodi “classici” di sequenziamento del DNA (Maxam&Gilbert e Sanger)

  • Generano una scaletta (ladder) di frammenti di DNA a singolo filamento, ciascuno più lungo del precedente di un nucleotide
  • Prevedono quattro reazioni separate per per ciascun nucleotide
  • I frammenti di dimensioni crescenti sono separati mediante corsa elettroforetica su gel di poliacrilammide
  • A corsa ultimata il gel viene posto a contatto con una pellicola radiografica sulla quale lascia impressa la disposizione delle bande
  • La sequenza delle bande sulla lastra si “legge” in successione dal basso verso l’alto (dai frammenti piccoli a quelli grandi)
  • L’identificazione del nucleotide presente in una data posizione (sequenziamento) dipende dal “canale” in cui si trova la banda

Il metodo di Maxam & Gilbert


Le reazioni di Maxam & Gilbert


Sequenziamento del DNA (metodo di Sanger)


Sequenziamento manuale


Tappe del sequenziamento automatizzato

  1. Estrazione di DNA o RNA
  2. PCR o amplificazione mediante clonaggio
  3. Purificazione del campione di DNA
  4. Cycle Sequencing
  5. Precipitazione dei prodotti di cycle sequencing
  6. Elettroforesi capillare
  7. Analisi dei dati

Sequenziatori a fluorescenza


Un centro di sequenziamento del DNA (1998)


Un sequenziatore automatico di DNA

Nel filmato sono mostrati due sequenziatori automatici in cui i frammenti dei campioni di DNA da sequenziare sono separati mediante elettroforesi capillare.

I due sequenziatori di DNA, rispettivamente a 48 ed a 16 capillari (mod.3730 e 3100 della Applera Genomics), sono installati presso il servizio di sequenziamento del DNA del CEINGE Biotecnologie Avanzate di Napoli.


Un robo-pipettatore in azione

Nel filmato è mostrato in azione una stazione di pipettaggio automatizzato della Beckmann installata presso il servizio di sequenziamento del DNA del CEINGE Biotecnologie Avanzate di Napoli.


Il sequenziatore di DNA 454 Life Science


La PCR (Polymerase Chain Reaction)


Amplificazione di una regione di DNA con la PCR


Assemblaggio della reazione di PCR

Nel filmato è mostrato l’assemblaggio in laboratorio di una reazione di PCR.

L’apparecchio per la PCR (termocycler) mostrato nel filmato è il mod. 3700 della Applied Biosystems.


Sintesi automatizzata di oligonucleotidi

Nel filmato sono mostrati due sintetizzatori automatici di oligonucleotidi della Applied Biosystems.


PCR quantitativa


PCR quantitativa automatizzata (Real Time) – I


La curva di amplificazione è iperbolica


Amplificazione di sequenze differenti


PCR quantitativa automatizzata (Real Time) – II


I materiali di supporto della lezione

Alberts B & al. Biol. Mol. della Cellula (essenziale) Zanichelli Cap. 10

Brown TA Genomi II EdiSES Cap. 4,6

Brown TA Biotecnologie Molecolari Zanichelli Cap. 9,10

Lewin B Il Gene (ed. compatta) Zanichelli

Watson JD & al. Biologia Molecolare del Gene Zanichelli Cap. 20

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