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Vincenzo De Simone » 3.Metodiche di estrazione e di analisi degli acidi nucleici


I – Struttura ed Organizzazione degli Acidi Nucleici

I-C) Metodiche di estrazione e di analisi degli acidi nucleici: (spettrofotometria, elettroforesi, Southern blotting)

Prof. Vincenzo De Simone

Dott.ssa Luisa De Magistris

Assorbimento delle basi azotate


La legge di Lambert-Beer


“Lettura” del DNA allo spettrofotometro

Il filmato mostra la determinazione della concentrazione di un campione di DNA effettuata mediante lettura dell’assorbimento a 260 nm con uno spettrofotometro.

Lettura del DNA allo spettrofotometro

Lettura del DNA allo spettrofotometro


Denaturazione e rinaturazione


Rinaturazione del DNA


Assorbanza e denaturazione


Separazione di frammenti di DNA per elettroforesi su gel


Separazione di frammenti di DNA mediante elettroforesi su gel


Effetto del % di agarosio sulla migrazione del DNA


Preparazione di un gel di agarosio all’1,2%

Il filmato mostra la preparazione di un gel di agarosio per la separazione elettroforetica di frammenti di DNA generati mediante PCR o digestione con enzimi di restrizione. 1.2 grammi di agarosio sono sciolti al calore in 100 ml di soluzione tampone per elettroforesi TAE (Tris/Acetato/EDTA).

Alla soluzione tiepida è aggiunto il bromuro d’etidio, ed il gel ancora liquido è versato in uno “stampo” orizzontale nel quale, su uno dei lati, un “pettine” verticale formerà una serie di piccole cavità (pozzetti).

Preparazione di un gel di agarosio all’1,2%

Preparazione di un gel di agarosio all'1,2%


Elettroforesi del DNA su gel di agarosio

Il campione di DNA da analizzare, sciolto in una soluzione di “caricamento” contenente glicerolo e due diversi coloranti, è depositato nei pozzetti del gel, a sua volta immerso nel tampone di corsa in una vaschetta per elettroforesi orizzontale.

L’andamento della separazione elettroforetica è evidenziato dalla migrazione dei due coloranti verso il polo positivo.

Preparazione di un gel di agarosio all’1,2%

Preparazione di un gel di agarosio all'1,2%


Purificazione di frammenti di DNA

E’ illustrata la procedura per la purificazione di un frammento di DNA separato mediante elettroforesi.

Purificazione di frammenti di DNA

Purificazione di frammenti di DNA


Southern (o Northern) blotting


La procedura del Southern blotting

E’ illustrata la procedura del Southern blotting per il trasferimento di frammenti di DNA separati mediante elettroforesi su gel di agarosio ad un filtro di nitrocellulosa.

Estrazione di DNA plasmidico da E.coli

Il filmato illustra la procedura di estrazione di DNA plasmidico da colture di E. coli. Il “protocollo” dettagliato è riportato nelle due diapositive seguenti.

Estrazione di DNA plasmidico da E. coli

Estrazione di DNA plasmidico da E. coli


Minipreparazioni di DNA plasmidico


Minipreparazioni di DNA plasmidico


I materiali di supporto della lezione

Alberts B & al., Biologia Molecolare della Cellula (essenziale), Zanichelli, Cap. 10.

Brown TA, Genomi II, EdiSES, Cap. 2 (parte).

Brown TA, Biotecnologie Molecolari, Zanichelli, Cap. 3 (parte).

Lewin B., Il Gene (ed. compatta), Zanichelli, Cap. 20.

Watson JD & al., Biologia Molecolare del Gene, Zanichelli, Cap. 20.

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