V – La Trascrizione negli eucarioti
V-C) Studio dei promotori e delle unità trascrizionali eucariotiche
Prof. Vincenzo De Simone
Dott.ssa Luisa De Magistris
Studio di un’unità trascrizionale
Il northern blotting
La RT-PCR (Reverse Transcriptase)
Studio della distribuzione di un trascritto
Identificazione del punto d’inizio della trascrizione: “S1 mapping”
Una variante: RNase protection
Identificazione del punto d’inizio della trascrizione:”primer extension”
Amplificazione della regione 5′ di un mRNA
Identificazione di sequenze di regolazione della trascrizione
Geni “reporter” per lo studio di un promotore
Espressione “stabile” o “transiente” di un gene estraneo inserito in cellule eucariotiche
Esempio di analisi funzionale di un promotore mediante delezioni progressive
Esempio di analisi funzionale di un promotore mediante mutagenesi (linker scanning)
Il saggio CAT
Il gene GFP come marcatore di espressione
Studio di un fattore trascrizionale mediante co-trasfezioni
Identificazione dei domini funzionali di un fattore trascrizionale mediante delezioni
Come si ottengono animali “transgenici”
Le piante “transgeniche”
I Potenti Mezzi della Postgenomica!
Sintesi di oligonucleotidi “in situ” (DNA chips)
Profili di espressione genica mediante microarrays a DNA
Profili di espressione genica – I
Un esperimento di microarrays
Analisi “in silico” di promotori eucariotici
Introduzione di DNA in cellule eucariotiche: trasfezione con Ca-PO4
Il filmato mostra la procedura di trasfezione di colture di cellule eucariotiche mediante coprecipitazione del DNA con Ca-PO4
Le lezioni del Corso
Argomenti ed organizzazione del corso di Biologia Molecolare in formato e-learning
1. Composizione chimica e conformazioni degli acidi nucleici
2. Organizzazione della cromatina eucariotica
3. Metodiche di estrazione e di analisi degli acidi nucleici
4. Componenti e funzionamento della forca di replicazione
5. Controllo dell'inizio e della terminazione della replicazione
7. Ricombinazione e Riparo del DNA
8. Ricombinazione sito-specifica e trasposoni
9. Costruzione di molecole ricombinanti in vitro
10. Struttura e funzionamento dell'RNA polimerasi batterica
11. Regolazione della trascrizione nei procarioti
12. I saggi EMSA e DNAse I footprinting
13. Le tre RNA polimerasi eucariotiche ed i relativi promotori
14. Regolazione della trascrizione negli eucarioti
15. Studio dei promotori e delle unità trascrizionali eucariotiche
16. RNA catalitici e maturazione degli RNA eucariotici
17. Ribozimi ed RNA interference
18. Applicazioni pratiche dei ribozimi e dell'RNA interference
19. Le tappe della sintesi delle proteine in procarioti ed eucarioti
I materiali di supporto della lezione
Alberts B & al. Biol. Mol. della Cellula (essenziale) Zanichelli
Brown TA Genomi II EdiSES Cap. 9
Brown TA Biotecnologie Molecolari Zanichelli Cap. 11
Lewin B Il Gene VIII Zanichelli
Lewin B Il Gene (ed. compatta) Zanichelli
Watson JD & al. Biologia Molecolare del Gene Zanichelli
Il Podcast della lezione
Le altre lezioni del corso con podcast
Argomenti ed organizzazione del corso di Biologia Molecolare in formato e-learning
1. Composizione chimica e conformazioni degli acidi nucleici
2. Organizzazione della cromatina eucariotica
3. Metodiche di estrazione e di analisi degli acidi nucleici
4. Componenti e funzionamento della forca di replicazione
5. Controllo dell'inizio e della terminazione della replicazione
7. Ricombinazione e Riparo del DNA
8. Ricombinazione sito-specifica e trasposoni
9. Costruzione di molecole ricombinanti in vitro
10. Struttura e funzionamento dell'RNA polimerasi batterica
11. Regolazione della trascrizione nei procarioti
12. I saggi EMSA e DNAse I footprinting
13. Le tre RNA polimerasi eucariotiche ed i relativi promotori
14. Regolazione della trascrizione negli eucarioti
15. Studio dei promotori e delle unità trascrizionali eucariotiche
16. RNA catalitici e maturazione degli RNA eucariotici
17. Ribozimi ed RNA interference
18. Applicazioni pratiche dei ribozimi e dell'RNA interference
19. Le tappe della sintesi delle proteine in procarioti ed eucarioti
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