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Giovanni Paolella » 9.Centrifugazione


Biotecnologie cellulari e molecolari

Centrifugazione

Prof. Giovanni Paolella

Dott. Leandra Sepe

Prof. Mara Bevilacqua

Centrifugazione

La centrifugazione consente la separazione di molecole e particelle sulla base del loro differente comportamento in un campo gravitazionale. Distinguiamo una centrifugazione preparativa e una centrifugazione analitica, la prima è utilizzata per estrarre da una sospensione componenti da sottoporre ad analisi successive, la seconda per conoscere le componenti e le caratteristiche di molecole o particelle.

La centrifugazione preparativa è tipicamente usata per separare cellule, frazioni subcellulari, organelli, virus, membrane o macromolecole, mentre la centrifugazione analitica è tipicamente utilizzata per lo studio di caratteristiche di sedimentazione di molecole purificate. In generale, i metodi preparativi possono essere utilizzati su scala diversa, adattandosi a quantità molto grandi o molto piccole di materiale di partenza, mentre quelli analitici utilizzano quantità piuttosto limitate.

Centrifugazione

Forza centrifuga relativa

In una centrifuga da laboratorio, un rotore (vedi figura A), che contiene i campioni, viene fatto girare ad alta velocità intorno al suo asse generando un campo gravitazionale. La forza centrifuga (Fc) che agisce sul campione dipende dalla sua massa (m), dalla velocità angolare (w) dalla distanza (r) dall’asse di rotazione, secondo l’equazione:

Fc = mw2r

Poichè la forza di gravità (Fg) che agisce su un corpo è uguale al prodotto della massa per l’accelerazione di gravità (g), definiamo la Forza Centrifuga Relativa (RCF), cioè il rapporto tra la forza agente su una particella posta in rotazione e il peso della stessa, come:

RCF = Fc/Fg = mω2r/mg = ω2 r/g

Esprimendo la velocità angolare in giri al minuto (rpm) e sostituendo a g il suo valore che, sulla superficie terrestre, è pari a 980 cm/sec2, risulta che:

RCF = (2πrpm/60)2r/3600 = 1.118 x 10-5 x rpm2 x r

Puoi provare a usare questo normogramma per valutare quali velocità e quali raggi sono necessari per ottenere una RCF di 20000 g.

Fig. A

Fig. A


Centrifughe

In laboratorio si distinguono:

  • centrifughe da banco, utilizzate generalmente per isolare rapidamente materiali che sedimentano velocemente (cellule, nuclei, ac.nucleici o proteine, etc.).
    • possono essere refrigerate od operare a temperatura ambiente
    • sono utili per centrifugare volumi relativamente piccoli (fino a 50 ml)
    • hanno velocità da 4000 a 15000 rpm (RCF fino a 10000 x g)
    • possono alloggiare sia rotori ad angolo fisso che a braccio oscillante.
  • centrifughe di grande capacità, utilizzate per la sedimentazione di cellule, batteri, frazioni subcellulari di grandi dimensioni, acidi nucleici e proteine precipitati
    • hanno capacità da pochi ml a oltre a 2 litri
    • usano diversi rotori, ad angolo fisso o a braccio oscillante
    • raggiungono velocità fino a 25000 rpm
  • ultracentrifughe, refrigerate, con camera del rotore sigillata e sotto vuoto, per raggiungere velocità molto elevate. Vengono utilizzate per la sedimentazione di acidi nucleici, proteine, piccoli organelli (es: ribosomi)
    • raggiungono velocità max 80000 rpm (RCF fino a 600000 g)
    • mantengono uno stretto controllo di temperatura, velocità e del bilanciamento
    • trattano volumi piccoli ma possono arrivare fino a 200-300 ml

Tipi di rotori

I rotori a corredo delle centrifughe si distiguono in:

  • ad angolo fisso (in alto in figura), in cui le particelle, muovendosi in senso radiale sotto l’influenza del campo centrifugo, incontrano la parete della provetta e scivolano su di essa fino al fondo formando un sedimento piccolo e compatto. I tubi sono ospitati in alloggiamenti inclinati secondo un angolo fisso, da 15 a 40°. Il cammino percorso dalle particelle è breve e la sedimentazione rapida.
  • a braccio oscillante (in basso in figura), in cui il tubo contente il campione, che a riposo è in posizione verticale, durante la centrifugazione, sottoposto alla forza centrifuga, si dispone in posizione orizzontale, perpendicolare all’asse di rotazione. Durante la decelerazione, il tubo ritorna nella posizione originaria.
  • verticali, in cui il tubo contenente il campione rimane permanentemente in posizione verticale. In questi rotori il cammino da percorrere è molto breve e i tempi di sedimentazione si accorciano in maniera significativa, tuttavia un eventuale sedimento si trova normalmente attaccato sulla parete laterale del tubo. Questi rotori sono usati principalmente per la centrifugazione in gradiente.

Sedimentazione

Particelle con massa diversa sottoposte allo stesso campo centrifugo, sedimentano a velocità diversa. La velocità di sedimentazione di una particella in sospensione, in un campo centrifugo, dipende da:

  • campo centrifugo applicato
  • distanza tra la particella e l’asse di rotazione
  • densità e viscosità del mezzo
  • densità della particella
  • dimensioni e forma della particella

L’analisi della velocità di sedimentazione di una particella in sospensione può essere utilizzata per studiarne le proprietà. Una misura molto usata è il coefficiente di sedimentazione (S), che corrisponde alla velocità di sedimentazione per unità di campo centrifugo applicato, ha le dimensioni di un tempo e si misura in Svedberg.

1 S = 10-13 sec

Nella figura e nello schema che trovi seguendo questo link sono riportati, come esempio, i coefficienti di sedimentazione di alcune molecole, strutture cellulari e organelli.

Densità e sedimentazione

Centrifugazione differenziale

Una miscela di particelle eterogenee e approssimativamente sferiche ma di densità e dimensioni diverse, può quindi essere separata mediante centrifugazione. Nell’ambito di un lisato cellulare, ad esempio, densità, dimensione e forma delle varie componenti determinano la velocità di sedimentazione: particelle più grandi e dense avranno tempi di sedimentazione più brevi.

La centrifugazione differenziale sfrutta la differente velocità di sedimentazione di particelle di diverse dimensioni e densità. Le diverse componenti vengono separate mediante tappe di centrifugazione successive, aumentando gradualmente il campo centrifugo applicato (RCF). In questo modo, ad ogni tappa, si ottiene un sedimento contenente uno specifico tipo di particelle, ed un sopranatante contenente quelle non ancora sedimentate. In questo modo vengono separate le varie componenti cellulari. Ad esempio: pochi minuti a 1000 g sono sufficienti a far sedimentare cellule intere, mentre valori di RCF progressivamente più elevati sono necessari per far sedimentare nuclei, membrane e organelli, vescicole. RCF molto più elevati sono necessari per la sedimentazione di ribosomi e altri componenti multimolecolari.

Centrifugazione differenziale

Centrifugazione in gradiente di densità

La centrifugazione in gradiente di densità sfrutta differenze di dimensioni, forma e densità delle particelle da separare.

Il gradiente di densità viene preparato a partire da diversi tipi di soluti, caratterizzati da buona solubilità, non tossicità e purezza; comunemente usati sono:

  • Sali di minerali pesanti, come il CsCl
  • Piccole molecole organiche come il saccarosio
  • Polimeri sintetici come il ficoll
  • Silice colloidale come il percoll

La formazione del gradiente di densità all’interno del tubo da centrifuga può avvenire durante la centrifugazione (gradiente autoformato), o prima (gradiente preformato). In questo caso, il gradiente può essere di tipo continuo, se la densità del soluto cresce in maniera graduale lungo il tubo da centrifuga, o di tipo discontinuo, se la densità cresce in modo discontinuo per effetto della stratificazione di soluzioni di densità crescente; due diversi dispositivi sono utilizzati per la preparazione del gradiente continuo e discontinuo.

Centrifugazione zonale

La centrifugazione zonale consiste nella sedimentazione delle particelle in ZONE discrete. E’ usata per la separazione di particelle di densità simile ma di massa diversa come organelli, subunità ribosomali, ibridi RNA –DNA, proteine. Trattandosi di un metodo dinamico, la durata della centrifugazione deve essere sufficiente a determinare la separazione delle componenti, ma inferiore al tempo necessario alla completa sedimentazione al fondo della provetta.

Come è possibile osservare a questo link, si procede attraverso:

  1. Formazione di un gradiente continuo di densità (ad esempio di saccarosio)
  2. Stratificazione del campione sul gradiente
  3. Raccolta di frazioni per l’analisi

Centrifugazione isopicnica

A differenza della centrifugazione zonale, in cui si sfrutta la diversa velocità con cui le particelle si muovono all’interno di un gradiente, la centrifugazione isopicnica è una centrifugazione all’equilibrio, che consiste nel portare ogni componente della miscela ad un livello corrispondente alla propria densità (figura A). Si tratta quindi di una tecnica che separa le particelle di una miscela esclusivamente in base alla densità, e non in base alla forma ed alle dimensioni. Una volta raggiunto l’equilibrio, questo non viene alterato dal tempo di centrifugazione.

  • il gradiente viene allestito utilizzando una soluzione la cui densità massima deve essere superiore a quella di tutte le particelle da separare
  • il campione viene miscelato alla soluzione
  • dopo la centrifugazione, frazioni corrispondenti ai diversi livelli di densità vengono raccolte e analizzate

Questa tecnica è tipicamente utilizzata per la separazione di acidi nucleici in gradienti di CsCl (un tipico tubo da centrifuga contenente bande di acidi nucleici è riportato in figura B).

Fig. A

Fig. A

Fig. B

Fig. B


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