Centrifugazione
Prof. Giovanni Paolella
Dott. Leandra Sepe
Prof. Mara Bevilacqua
La centrifugazione consente la separazione di molecole e particelle sulla base del loro differente comportamento in un campo gravitazionale. Distinguiamo una centrifugazione preparativa e una centrifugazione analitica, la prima è utilizzata per estrarre da una sospensione componenti da sottoporre ad analisi successive, la seconda per conoscere le componenti e le caratteristiche di molecole o particelle.
La centrifugazione preparativa è tipicamente usata per separare cellule, frazioni subcellulari, organelli, virus, membrane o macromolecole, mentre la centrifugazione analitica è tipicamente utilizzata per lo studio di caratteristiche di sedimentazione di molecole purificate. In generale, i metodi preparativi possono essere utilizzati su scala diversa, adattandosi a quantità molto grandi o molto piccole di materiale di partenza, mentre quelli analitici utilizzano quantità piuttosto limitate.
In una centrifuga da laboratorio, un rotore (vedi figura A), che contiene i campioni, viene fatto girare ad alta velocità intorno al suo asse generando un campo gravitazionale. La forza centrifuga (Fc) che agisce sul campione dipende dalla sua massa (m), dalla velocità angolare (w) dalla distanza (r) dall’asse di rotazione, secondo l’equazione:
Fc = mw2r
Poichè la forza di gravità (Fg) che agisce su un corpo è uguale al prodotto della massa per l’accelerazione di gravità (g), definiamo la Forza Centrifuga Relativa (RCF), cioè il rapporto tra la forza agente su una particella posta in rotazione e il peso della stessa, come:
RCF = Fc/Fg = mω2r/mg = ω2 r/g
Esprimendo la velocità angolare in giri al minuto (rpm) e sostituendo a g il suo valore che, sulla superficie terrestre, è pari a 980 cm/sec2, risulta che:
RCF = (2πrpm/60)2r/3600 = 1.118 x 10-5 x rpm2 x r
Puoi provare a usare questo normogramma per valutare quali velocità e quali raggi sono necessari per ottenere una RCF di 20000 g.
In laboratorio si distinguono:
I rotori a corredo delle centrifughe si distiguono in:
Particelle con massa diversa sottoposte allo stesso campo centrifugo, sedimentano a velocità diversa. La velocità di sedimentazione di una particella in sospensione, in un campo centrifugo, dipende da:
L’analisi della velocità di sedimentazione di una particella in sospensione può essere utilizzata per studiarne le proprietà. Una misura molto usata è il coefficiente di sedimentazione (S), che corrisponde alla velocità di sedimentazione per unità di campo centrifugo applicato, ha le dimensioni di un tempo e si misura in Svedberg.
1 S = 10-13 sec
Nella figura e nello schema che trovi seguendo questo link sono riportati, come esempio, i coefficienti di sedimentazione di alcune molecole, strutture cellulari e organelli.
Una miscela di particelle eterogenee e approssimativamente sferiche ma di densità e dimensioni diverse, può quindi essere separata mediante centrifugazione. Nell’ambito di un lisato cellulare, ad esempio, densità, dimensione e forma delle varie componenti determinano la velocità di sedimentazione: particelle più grandi e dense avranno tempi di sedimentazione più brevi.
La centrifugazione differenziale sfrutta la differente velocità di sedimentazione di particelle di diverse dimensioni e densità. Le diverse componenti vengono separate mediante tappe di centrifugazione successive, aumentando gradualmente il campo centrifugo applicato (RCF). In questo modo, ad ogni tappa, si ottiene un sedimento contenente uno specifico tipo di particelle, ed un sopranatante contenente quelle non ancora sedimentate. In questo modo vengono separate le varie componenti cellulari. Ad esempio: pochi minuti a 1000 g sono sufficienti a far sedimentare cellule intere, mentre valori di RCF progressivamente più elevati sono necessari per far sedimentare nuclei, membrane e organelli, vescicole. RCF molto più elevati sono necessari per la sedimentazione di ribosomi e altri componenti multimolecolari.
La centrifugazione in gradiente di densità sfrutta differenze di dimensioni, forma e densità delle particelle da separare.
Il gradiente di densità viene preparato a partire da diversi tipi di soluti, caratterizzati da buona solubilità, non tossicità e purezza; comunemente usati sono:
La formazione del gradiente di densità all’interno del tubo da centrifuga può avvenire durante la centrifugazione (gradiente autoformato), o prima (gradiente preformato). In questo caso, il gradiente può essere di tipo continuo, se la densità del soluto cresce in maniera graduale lungo il tubo da centrifuga, o di tipo discontinuo, se la densità cresce in modo discontinuo per effetto della stratificazione di soluzioni di densità crescente; due diversi dispositivi sono utilizzati per la preparazione del gradiente continuo e discontinuo.
La centrifugazione zonale consiste nella sedimentazione delle particelle in ZONE discrete. E’ usata per la separazione di particelle di densità simile ma di massa diversa come organelli, subunità ribosomali, ibridi RNA –DNA, proteine. Trattandosi di un metodo dinamico, la durata della centrifugazione deve essere sufficiente a determinare la separazione delle componenti, ma inferiore al tempo necessario alla completa sedimentazione al fondo della provetta.
Come è possibile osservare a questo link, si procede attraverso:
A differenza della centrifugazione zonale, in cui si sfrutta la diversa velocità con cui le particelle si muovono all’interno di un gradiente, la centrifugazione isopicnica è una centrifugazione all’equilibrio, che consiste nel portare ogni componente della miscela ad un livello corrispondente alla propria densità (figura A). Si tratta quindi di una tecnica che separa le particelle di una miscela esclusivamente in base alla densità, e non in base alla forma ed alle dimensioni. Una volta raggiunto l’equilibrio, questo non viene alterato dal tempo di centrifugazione.
Questa tecnica è tipicamente utilizzata per la separazione di acidi nucleici in gradienti di CsCl (un tipico tubo da centrifuga contenente bande di acidi nucleici è riportato in figura B).
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