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Biotecnologie cellulari e molecolari

Elettroforesi

Prof. Giovanni Paolella

Dott. Leandra Sepe

Prof. Mara Bevilacqua

Elettroforesi

L’elettroforesi è una tecnica di separazione fra le più usate in biochimica, che sfrutta la diversa velocità di migrazione di particelle cariche sotto l’influenza di un campo elettrico.

E’ possibile sottoporre a separazione elettroforetica molecole che possiedono gruppi o residui ionizzabili, e dunque aminoacidi e proteine, nucleotidi e acidi nucleici.

  • La tecnica è spesso usata a scopi analitici per determinare:
  • numero di proteine presenti in una miscela
  • grado di purezza
  • punto isoelettrico
  • peso molecolare

Si distinguono, in generale, metodi frontali, in cui la separazione avviene in soluzione libera, e metodi zonali che si avvalgono dell’utilizzo di un mezzo poroso come carta, gel o acetato di cellulosa.

Velocità di migrazione

La mobilità elettroforetica (μ) di una particella è pari al rapporto tra la sua velocità di migrazione e l’entità del campo elettrico applicato (V/E).

  • La velocità di migrazione dipende a sua volta da diversi fattori :
  • Campo elettrico applicato
  • Caratteristiche della particella quali massa, carica, dimensioni e forma
  • Tipo di supporto utilizzato per eseguire le separazione

La natura del supporto può essere anche molto diversa, infatti la separazione può avvenire o su supporti solidi porosi come carta da filtro o di acetato di cellulosa, o su gel, a base di agarosio o poliacrilammide. Le molecole da separare possono essere ritenute dal supporto mediante la presenza di ‘code’ (assorbimento), oppure mantenute su di esso per elettroendosmosi attraverso gruppi carichi presenti sulla superficie del supporto. La carta espone gruppi – COOH, l’agarosio gruppi – SO4-, il vetro espone – Si-OH

Fattori che influenzano la migrazione

La velocità di migrazione di una particella dipende, oltre che dal supporto scelto, dal campo elettrico applicato, dal tampone utilizzato per la corsa e dalle caratteristiche della particella.

La differenza di potenziale tra gli elettrodi (E) genera un gradiente di potenziale elettrico definito da:

E = V / d

dove V = voltaggio applicato e d = distanza fra gli elettrodi.

L’intensità della corrente (I) condotta è invece determinata da:

I=V/R

Dove V = voltaggio applicato e R = resistenza

La resistenza aumenta all’aumentare della distanza fra gli elettrodi, mentre, al diminuire della resistenza, aumentano la forza ionica del tampone e la temperatura.

La corrente viene condotta principalmente dagli ioni del tampone che ha la funzione di mantenere le molecole del campione in uno stato ionizzato, senza legarsi ai composti da separare. La sua concentrazione oscilla tipicamente tra da 0.05 e 0.10 M, mentre il suo pH determina, influenza e stabilizza la migrazione.

Le molecole si separano sulla base del rapporto carica/massa.

Apparato elettroforetico

La strumentazione necessaria a condurre una corsa elettroforetica comprende un alimentatore e un apparato (camera elettroforetica) di tipo diverso, a seconda del supporto utilizzato. Esempi di apparati comunemente usati per corse elettroforetiche sono quello per elettroforesi verticale su gel di acrilamide, o quello per elettroforesi orizzontale su carta.

Gli alimentatori devono essere in grado di fornire tensione e corrente adeguata. Sono in uso alimentatori a bassa tensione e ad alta tensione, e alimentatori ad elevata corrente per applicazioni specifiche come il trasferimento.

Per quanto riguarda i supporti, molto usati sono i gel di poliacrilammide, agarosio, oppure carta da filtro o acetato di cellulosa.

Elettroforesi su gel

La separazione elettroforetica su gel prevede che la miscela di molecole da separare sia caricata su di un supporto gelatinoso preparato a base di agarosio o poliacrilammide. L’agarosio è normalmente utilizzato per la separazione di frammenti di acidi nucleici aventi dimensioni tipicamente comprese tra 500 bp a 20 kb circa; con alcune variazioni è possibile arrivare a separare anche frammenti parecchio più grandi. Gel di poliacrilammide sono invece più comunemente usati per per la separazione di proteine e per frammenti di dna più piccoli, da pochi nucleotidi a 2-3 kb circa.

Per molecole come il DNA, in cui il rapporto carica / massa è praticamente costante, questi supporti permettono la separazione comportandosi come un reticolo, che rallenta il movimento delle molecole, in maniera dipendente dalle loro dimensioni. In queste condizioni la velocità è approssimativamente proporzionale all’ inverso del logaritmo della loro lunghezza.

La migrazione è inoltre influenzata dalle condizioni in cui avviene la corsa elettroforetica: è infatti possibile separare molecole in condizioni native, o anche in condizioni denaturanti o riducenti.

Con specifiche tecniche, è inoltre possibile separare le proteine sulla base del punto isoelettrico (isoelettrofocalizzazione IEF), o su di un gradiente (elettroforesi su gradiente). E’ infine possibile combinare la separazione prodotta da elettroforesi di tipo diverso eseguendo una elettroforesi bidimensionale.

Elettroforesi su gel di agarosio

Il gel di agarosio, tipicamente usato per la separazione di acidi nucleici, viene preparato portando ad ebollizione l’agarosio in polvere mescolato al tampone. La soluzione ottenuta si versa in uno stampo dove avviene la gelificazione e dove, con un pettine verranno ricavati gli spazi per depositare i campioni. Il gel viene poi immerso completamente nel tampone. La migrazione dei campioni avviene in orizzontale verso il polo positivo (anodo) sulla base alla loro massa poiché il loro rapporto carica/massa è costante. La loro velocità di migrazione dipende da:

  1. dimensioni dei frammenti
  2. percentuale dell’agarosio nel gel
  3. voltaggio applicato

Frammenti lineari più piccoli migrano più velocemente rispetto a quelli più grandi, mentre, a parità di peso molecolare, il DNA circolare migra più velocemente di un DNA lineare, in quanto assume una conformazione detta super avvolta (super coiled DNA). Per la rivelazione del campione si sfrutta la colorazione con etidio bromuro, una molecola fluorescente che contiene un gruppo planare capace di intercalarsi tra le coppie di basi del DNA, e che pertanto va trattato con cautela, in quanto mutageno. Il colorante viene visualizzato irradiando il gel con raggi U.V. e selezionando l’emissione con un filtro rosso. Un transilluminatore consente la visualizzazione del gel e l’immagine può essere registrata fotografandola su film o acquisita con fotocamere digitali. La sensibilità del rilevamento è solitamente superiore a 0.1 μg di DNA. L’elettroforesi su gel di agarosio viene utilizzata, in combinazione con tecniche di ibridazione, per l’analisi diretta di DNA genomici. Applicazioni diagnostiche tipiche includono la valutazione di polimorfismi della lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP) e il cosiddetto DNA fingerprint.

Gel di acrilammide

Il gel di poliacrilammide si ottiene dalla polimerizzazzione di molecole di acrilammide mediante formazione di legami crociati in presenza di metilen-bis-acrilammideacrilammide. Il processo di polimerizzazione è innescato dall”aggiunta di tetrametilendiammina (TEMED) e ammonio persolfato. L’utilizzo di gel di poliacrilammide si applica alla separazione di frammenti di DNA se l’elettroforesi può essere condotta in condizioni denaturanti con l’aggiunta di urea 7M. In queste condizioni i frammenti di DNA sono tenuti denaturati e migrano come molecole a singolo filamento.

La sequenza nucleotidica di un frammento di acido nucleico può essere determinata utilizzando l’elettroforesi in gel di poliacrilammide. Per questa applicazione vengono utilizzati gel lunghi (fino a 50-60 cm) e sottili, che richiedono voltaggi elevati, fino a 2000 V.

I campioni caricati su gel, dopo la separazione elettroforetica, possono essere resi visibili mediante utilizzo di metodi in grado di colorare le molecole separate. Silver stain e colorazione con Coomassie brilliant blue o con reagenti di colorazione della serie SYPRO (Sigma), sono metodi frequentemete utilizzati per la rivelazione di proteine. L’analisi densitometrica delle bande corrispondenti a ciascun componente può essere utilizzata per determinarne i rapporti ed eseguire una stima quantitativa dei campioni

L’elettroforesi su gel è tipicamente una tecnica analitica, tuttavia essa può essere usata a scopi preparativi, perchè le molecole contenute nelle banda possono essere recuperate dal gel per diffusione o mediante elettroeluizione e sottoposte ad analisi successive.

Elettroforesi di proteine

La separazione dei componenti di una miscela eterogenea di proteine mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide può essere ottimizzata modificando opportunamente la porosità del gel, attraverso l’uso di acrilamide e bis-acrilamide in rapporti diversi per la preparazione del gel.

La velocità di migrazione di una proteina su gel dipende da diversi fattori:

  • corrente applicata
  • dimensione
  • carica netta

La carica netta di una proteina dipende dal pH del tampone: a pH neutro la maggior parte delle proteine è sotto forma di anioni (-) e migra quindi verso il polo positivo.

Una corsa elettroforetica in condizioni native permette di separare enzimi o proteine preservando la loro attività biologica. In queste condizioni le proteine conservano la loro conformazione e la separazione avviene sulla base del rapporto carica/massa. La conservazione della conformazione è importante per il mantenimento dell’attività biologica: proteine estratte da gel sono attive e possono essere utilizzate in ulteriori esperimenti.

Elettroforesi in SDS

L’elettroforesi in presenza di Sodio Dodecil Solfato (SDS) è largamente usata per la determinazione del peso molecolare delle proteine. In presenza di SDS , le strutture secondarie sono denaturate e le proteine vengono dotate di un gran numero di cariche negative, che rendono la carica complessiva essenzialmente proporzionale alla lunghezza della catena polipeptidica. Dal momento che tutte le proteine sono cariche allo stesso modo, e che sono essenzialmente in forma lineare, la separazione avviene solo sulla base delle dimensioni. Un tipico allestimento di elettroforesi in SDS prevede:

  • uno stacking gel di acrilamide al 4%, per far entrare le proteine nel gel
  • un running gel al 10% in cui avviene la reale separazione

Dopo la corsa si procede a:

  • fissaggio del gel in metanolo e acido acetico e colorazione con Blu di comassie
  • valutazione della purezza dei campioni
  • determinazione del peso molecolare delle proteine rispetto a standard di riferimento.

In queste condizioni, la mobilità elettroforetica è circa proporzionale all’inverso del logaritmo decimale della massa molecolare.

Segui questo link per vedere la procedura in azione.

Immunoblot

Le proteine separate sul gel di poliacrilammide possono essere trasferite su un filtro di nitrocellulosa dove poi vengono immobilizzate mantenendo le stesse posizioni relative che occupavano nel gel. Le proteine sul filtro possono essere raggiunte e riconosciute da anticorpi specifici. La procedura prende il nome di immunoblot e consente di identificare proteine anche se presenti in piccole quantità e di definire il loro peso molecolare.

Una applicazione clinica del Western Blot consente di studiare proteine virali e di diagnosticare malattie virali come l’HIV. In un esempio di applicazione sono riportati i campioni di controllo positivo, controlli negativi e campioni di pazienti con sospetto contagio. La positività al virus può essere confermata solo dalla presenza dei seguenti tipi di proteine:

  • gp160 viral envelope precursor (env)
  • gp120 viral envelope protein (env) binds to CD4
  • p24 viral core protein (gag)
  • p31 Reverse Transcriptase (pol)

I criteri per l’interpretazione dei western blot per HIV sono stati definiti nel 1987:

  • Assenza di bande = campione negativo
  • Banda di p31 o di p24 e gp160 o gp120 = campione positivo
  • Presenza di bande diverse = campione non determinato

Isoelettrofocalizzazione

La tecnica di isoelettrofocalizzazione consente la separazione di sostanze anfotere sulla base del pH.

Il gel viene prodotto con miscele di anfoliti, acidi alifatici sintetici poliammino-policarbossilici, che formano un gradiente di pH nella matrice prima della sua polimerizzazione. Gli anfoliti disponibili commercialmente sono utilizzati per diversi range di pH, sia a banda larga (ad es. da pH 3 a pH 10), che a banda stretta (ad es. da pH 7 a pH 8).

I composti da separare migrano verso la zona di pH corrispondente al proprio punto isoelettrico (focalizzazione). Una calibrazione con proteine a pH noto è in genere utile.

Elettroforesi capillare

L’elettroforesi capillare (CE) trae vantaggio dall’uso dell’elettroosmosi per generare un flusso che è diretto in direzione opposta alla direzione di migrazione della maggior parte delle macromolecole, e ne contrasta quindi la migrazione. In un tubo capillare la parete ha tipicamente carica negativa, e i cationi sono disposti a formare un film contro di essa. L’applicazione di un campo elettrico genera un flusso di cationi verso il catodo, che trascina con sè il solvente e gli altri ioni, I quali però, se carichi negativamente, sono ritardati dall’attrazione del campo elettrico, in ragione della loro carica. I vantaggi della CE sono l’alta efficienza di separazione, i piccoli campioni necessari, la velocità dell’assemblaggio e della corsa, la facilità di automazione. La rilevazione dei campioni può essere effettuata mediante rilevazione di assorbanza o di fluorescenza alla estremità del tubo, è possibile inoltre accoppiare il sistema a una spettrometro di massa, che può valutare in tempo reale lo spettro delle molecole separate. Le molecole separate per questa via sono aminoacidi, ioni inorganici, molecole organiche cariche. L’uso di gel di acrilamide o agarosio, invece di solo buffer, permette invece di eseguire una elettroforesi equivalente a quella su gel, ma con i vantaggi dell’automazione. E’ usata per proteine, peptidi, acidi nucleici.

 

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