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Biotecnologie cellulari e molecolari

Esercitazione: Banche dati

Prof. Giovanni Paolella

Dott. Leandra Sepe

Descrizione dell’attività da svolgere

In questa esercitazione ti verrà richiesto di ottenere la sequenza e la CDS (sequenza codificante) del gene p27Kip1 umano.

A tale scopo utilizzerai SRS (Sequence Retrieval System), un sistema che consente di interrogare banche dati via WEB e di integrare record di diversi database. Consulterai in particolare i DB:

• EMBL
• SWISSPROT

Imparerai ad eseguire diversi tipi di query a seconda del risultato che vuoi ottenere, e ad utilizzare correttamente tutte le opzioni di ricerca che SRS mette a disposizione, per esempio:

• Utilizzo del campo description
• Utilizzo del campo organism name
• ……

Eseguirai poi una ricerca combinata di p27Kip1 in banche dati diverse

Alla fine dell’esercitazione dovresti essere in grado di avere informazioni dettagliate sul gene in esame, di ottenere la sequenza, la CDS, l’mRNA. Potrai poi lavorare con le sequenze ottenute utilizzando i programmi studiati fino a questo momento

SRS

Per accedere a SRS, vai all’indirizzo http://bioinfo.ceinge.unina.it ed esegui il login come indicato. Segui il link SRS presente sulla barra di sinistra. Osserva la home page in modo da acquisire familiarità col sistema e poi seleziona il link information per avere un’idea del numero e del tipo di banche dati accessibili attraverso SRS.

I principali vantaggi offerti da SRS derivano dalla possibilità di eseguire ricerche in uno o più campi di una o più banche dati, e di permettere una integrazione tra le diverse banche dati sfruttando i ‘collegamenti’ esistenti tra i record di diversi database. SRS è infatti in grado di interfacciarsi con molte banche dati, alcune contenenti sequenze, altre dati alquanto diversi come referenze bibliografiche, strutture tridimensionali di proteine, informazioni su malattie genetiche correlate.

Ricerca del gene di interesse

Per effettuare la ricerca della sequenza di p27kip1, può esserti utile ricordare che la banca dati EMBL raccoglie sequenze nucleotidiche determinate nei laboratori di tutto il mondo, e che, per ciascun gene, non è garantita l’unicità; infatti, oltre salla sequenza genica e all’mRNA, possono anche esserci frammenti nucleotidici di diversa lunghezza. Spesso è quindi conveniente cercare prima la sequenza proteica in un database meno ridondante come SWISSPROT e risalire poi alla corrispondente sequenza nucleotidica contenuta in EMBL; in questo modo il numero di record da analizzare potrà essere più contenuto.

Procedi dunque selezionando, in alto nella home page, la voce Select Databanks e subito dopo il DB Uniprot/Swissprot che contiene, come detto, sequenze aminoacidiche. Nota che se passi la freccia del mouse sul nome dei database ottieni una loro breve descrizione. Cliccando sulla voce Standard Query Form aprirai la pagina di ricerca standard. Come puoi vedere, quattro campi permettono di eseguire ricerche più o meno complesse: All text indica che la ricerca verrà eseguita in tutti i campi di ciascun record. E’ possibile, però, cambiare All text in uno qualsiasi degli altri campi disponibili per poter eseguire una ricerca mirata. SRS permette di cercare contemporaneamente in più campi del DB (i quattro campi di ricerca centrali).

Introduci nel campo description ‘p27kip1′ e nel campo Organism Name ‘human’. Esegui la ricerca cliccando su Search. Tieni presente che SRS ‘conosce’ solo la lingua inglese, per cui ciascun termine per cui esegui una ricerca deve essere indicato in questa lingua.

Osserva i dettagli del record:

• Per cosa codifica il gene? Qual è la funzione della proteina?
• Con quali altri nomi è conosciuta?
• Quanto è lunga la sequenza aminoacidica?

Ricerca combinata

La voce Combine search terms with, sulla sinistra nella pagina iniziale, permette di combinare due o più campi di ricerca, per esempio:

• per trovare i record che contengono a e b si usa AND;
• per trovare i record che contengono a o b si usa OR;
• per trovare i record che contengono a ma non b si usa BUT NOT.

Usa gli operatori AND, OR, BUT NOT per combinare le parole che costituiscono la stringa IL-1 alpha. Per esempio, nel campo description, le parole IL-1 e alpha possono esserere combinate con l’operatore & (AND – cioè vengono cercati i record che contengono nel campo description sia la parola IL-1 che alpha), oppure con l’operatore | (OR – cioè vengono cercati i record che contengono nel campo description o la parola IL-1 o la parola alpha), o con l’operatore ! (AND NOT – cioè vengono cercati i record che contengono nel campo description la parola IL-1 ma non la parola alpha). Se non usi nessun operatore, in modo predefinito viene usato l’operatore AND.

Prova ad eseguire ricerche combinate. Puoi usare IL-1 alpha o un qualsiasi altro gene di tuo interesse.

Ricerca in diverse banche dati

SRS è in grado di stabilire relazioni fra diversi tipi di database. Ad esempio gli si può chiedere qualcosa del tipo: trova tutte le sequenze di DNA dell’EMBL database che siano in relazione con il record SWISSPROT che stiamo esaminando. Per fare questo basta cliccare sul bottone Link presente sulla sinistra e selezionare poi il DB EMBL e, infine, cliccare su Search. Il risultato della ricerca è, come puoi vedere, una lista di cinque record EMBL elencati per codice di accesso. Per avere maggiori dettagli puoi cambiare il tipo di visualizzazione attraverso la sezione Display Options: prova a scegliere SeqSimpleView e applica le modifiche col bottone Apply Display Options.

Leggendo la descrizione dei cinque record appare evidente che il primo di essi contiene la sequenza del gene mentre il secondo record contiene l’mRNA con la CDS. Puoi vedere i dettagli di tutti i record, comprese le loro sequenze, cliccando sul link che contiene il nome del gene. A cosa corrispondono gli altri record? Puoi visualizzare le sequenze in formato FASTA selezionando i record corrispondenti attraverso la checkbox sulla loro sinistra, e cambiando, come prima, il tipo di visualizzazione (scegliere in questo caso FastaSeqs).

Hai cosi ottenuto:

La sequenza del gene, contenente, oltre alle regioni codificanti la proteina, anche eventuali regioni trascritte ma non tradotte (UTR) e gli introni.

La sequenza CDS contenente le sole regioni codificanti in successione.

Prova adesso ad allineare il gene e la sequenza codificante per individuare le giunzioni esoni-introni. Dovresti essere oramai in grado di sapere quali programmi utilizzare!

Esercizi

• Cerca con SRS in EMBL la sequenza nucleotidica il cui codice di accesso (accession number) è AF029082 e descrivere di cosa si tratta
• Cerca con SRS nel database SwissProt la proteina il cui Accession Number è Q9NZL3 e dire a quale specie appartiene
• Cerca tutte le caspasi (caspase) umane (SWISSPROT) espresse nel fegato (liver) e indica il numero di record ottenuti. Nota che la tessuto specificità nei record di SWISSPROT viene in genere riportata nel campo comment
• Cerca tutte le caspasi umane espresse nel fegato ma non nel rene (kidney) e indica il numero di record ottenuti
• Cerca tutte le caspasi umane e murine espresse nel fegato ma non nel polmone (lung) e indica il numero di record ottenuto
• Cerca il miglior allineamento locale fra la ciclina D3 umana e murina e fra la ciclina A2 umana e murina (proteine). Puoi ottenere le sequenze in formato FASTA con SRS (ciclina si scrive in inglese cyclin). Qual’è lo score dei due allineamenti?