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Biotecnologie cellulari e molecolari

Preparazione di acidi nucleici

Prof. Giovanni Paolella

Dott. Leandra Sepe

Prof. Mara Bevilacqua

Acidi nucleici

Il DNA è presente in forme diverse sia negli organismi procariotici che in quelli eucariotici. Nei procarioti, la maggior parte (98% o più) del DNA è presente in forma circolare o talvolta lineare nel cromosoma batterico (DNA genomico), mentre il rimanente 2% è costituito da piccoli elementi extracromosomiali, di norma circolari, presenti in più copie per cellula (DNA plasmidico, fagico).

Negli eucarioti il DNA genomico è presente in forma lineare nel nucleo sotto forma di cromosomi, inoltre, organelli come mitocondri e cloroplasti contengono un proprio DNA genomico che costituisce una quota tipicamente inferiore allo 0.2%. La quantità di DNA genomico per cellula dipende dal tipo e dalla complessità degli organismi.

L’RNA è presente in diverse forme: rRNA, quella predominante, tRNA, mRNA e diverse altre forme. Esistono procedure diverse che consentono la purificazione di ciascuna di esse.

Estrazione acidi nucleici

L’estrazione di acidi nucleici consiste nell’isolamento di DNA o RNA da tessuti o cellule eucariotiche o da procarioti. Esempi di materiale di partenza possono essere: tessuti animali o vegetali, cellule in coltura procariotiche o eucariotiche, organelli, liquidi biologici.

• L’estrazione degli acidi nucleici richiede l’applicazione di diverse metodiche, tra cui:
• frammentazione del tessuto di partenza e lisi cellulare
• allontanamento di detriti
• allontanamento di altre specie molecolari quali proteine, lipidi o carboidrati
• recupero del DNA o dell’RNA mediante precipitazione
• dosaggio

Queste procedure consentono l’estrazione di acidi nucleici totali, senza differenziare tra diverse specie di DNA o di RNA. E’ possibile eliminare sia l’uno che l’altro mediante, ad esempio, digestione enzimatica, in modo da ottenere DNA o RNA in forma pura. Procedure differenti sono invece necessarie per l’isolamento di forme specifiche di DNA o RNA, come ad esempio DNA genomico, plasmidi circolari, tRNA.

Frammentazione e lisi cellulare

La frammentazione di tessuti è in genere ottenuta con metodi meccanici come l’omogeneizzazione; per tessuti più resistenti, come quelli vegetali, risulta utile l’uso di vibrazioni ultrasoniche e cicli di congelamento/scongelamento.

Il mezzo utilizzato è costituito da una soluzione isotonica a composizione salina bilanciata che deve essere tamponata e assicurare l’integrità fisica e metabolica degli organuli.

La lisi cellulare viene generalmente ottenuta mediante rigonfiamento e shock osmotico in soluzione ipotonica. Alla soluzione è possibile aggiungere detergenti come il triton e agenti denaturanti come l’SDS o la guanidina. La proteinasi K è spesso utilizzata per digerire le proteine presenti. Il lisozima è spesso usato per digerire la parete cellulare batterica.

I detriti cellulari costituiti da membrane, organelli, ecc, possono essere allontanati per centrifugazione.

Purificazione e recupero di acidi nucleici

L’allontanamento di proteine e lipidi residui viene di norma ottenuto mediante estrazione con solventi organici come fenolo, cloroformio e alcool isoamilico. Questi solventi, vengono inizialmente aggiunti alla soluzione mediante miscelazione, ma, non essendo miscibili con l’acqua, rimangono separati; le due fasi vengono poi lasciate separare per gravità o per centrifugazione.

Le proteine si stratificano all’interfase cloroformio-acqua, mentre gli acidi nucleici rimangono in soluzione acquosa. Residui dei solventi organici utilizzati possono essere eliminati mediante estrazione in etere.

Gli acidi nucleici in soluzione acquosa vengono recuperati medinte precipitazione in etanolo al 70% in presenza di cationi monovalenti come sodio acetato o ammonio acetato. In queste condizioni il DNA tende ad aggregarsi in precipitati che possono essere raccolti mediante una bacchetta di vetro o recuperati mediante centrifugazione. L’uso di temperature basse (-20/-80°C) accelera il processo e facilita la precipitazione di piccole quantità di DNA. In questo caso, l’aggiunta di altri acidi nucleici o glicogeno facilita la precipitazione e rende più affidabile il recupero.

Dosaggio

Per dosaggio si intende la valutazione della quantità dell’acido nucleico ottenuto. Sono tipicamente usate tecniche di tipo:

Spettrofotometrico, che consiste nella determinazione dell’assorbanza a 260 nm, come descritto in altra parte del corso

Colorimetrico, che consiste nella determinazione spettrofotometrica dell’assorbanza da parte sostanze coloranti come difenilammina (che lega il desossiribosio e determina una colorazione celeste letta a 595nm) e orcinolo (che reagisce con il ribosio determinando una colorazione verde che viene letta a 670 nm).

Fluorimetrico, che consiste nell’uso di sostanze intercalanti fluorescenti come l’etidio bromuro, che legano il DNA in funzione del numero di basi. La fluorescenza viene spesso valutata dopo corsa elettroforetica, mediante scansione diretta del gel. Questo metodo risulta molto sensibile e permette di valutare contemporaneamente specie molecolari diverse avvantaggiandosi della separazione elettroforetica.

Preparazione di DNA specifici

Nella preparazione di DNA genomico è in genere importante limitare la frammentazione meccanica del DNA per ottenere frammenti di lunghezza media elevata. A questo scopo le fasi meccaniche sono ridotte al minimo e si preferisce l’uso di enzimi proteolitici. Il DNA viene tipicamente recuperato con una bacchetta di vetro per evitare la centrifugazione.

La preparazione di DNA plasmidico prevede la separazione di una piccola quantità di DNA circolare separandolo da quello genomico, molto più abbondante. A questo scopo si utilizza la tendenza del DNA genomico a precipitare in presenza di NaOH e potassio acetato, per separarlo, mediante centrifugazione, dal DNA plasmidico che rimane in soluzione (figura A). Il DNA plasmidico intatto (super avvolto) può essere separato mediante centrifugazione all’equilibrio in gradiente di Cloruro di Cesio.

Sono oggi disponibili inoltre metodi di preparazione che ricorrono alla separazione mediante cromatografia su colonna; si tratta di metodiche certamente rapide e spesso utilizzate per la produzione di kit commerciali.