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Giovanni Paolella » 17.Purificazione di proteine


Biotecnologie cellulari e molecolari

Purificazione di proteine

Prof. Giovanni Paolella

Dott. Leandra Sepe

Prof. Mara Bevilacqua

Purificazione di proteine

La purificazione di una proteina consiste nell’isolare una molecola proteica di interesse da una miscela eterogenea contenente altre proteine, o anche acidi nucleici, polisaccaridi, lipidi e molecole più piccole (zuccheri, peptidi, aminoacidi, ormoni, etc.). La purificazione sfrutta le differenze di proprieta’ chimico-fisiche tra la molecola che si cerca di purificare e le altre presenti nella miscela, ad esempio la dimensione e la forma o il contenuto in aminoacidi acidi o basici (la carica di una proteina è la somma delle cariche (+) e (-) ad un dato pH sulla superficie). Altri esempi sono:

  • punto isoelettrico e distribuzione di carica (spesso non uniforme sulla superficie)
  • solubilità (influenzata da pH e forza ionica), densità (~1.4 g/cm3) lipoproteine<proteine<fosfoproteine), idrofobicità (numero e distribuzione dei residui idrofobici)
  • capacità di legare metalli o altre molecole
  • capacità di associazione e dissociazione (reversibili)
  • specificità di sequenza o di struttura (anticorpi)
  • presenza di modifiche post-traduzionali
  • altre proprietà (per esempio la termolabilità)

A seconda degli scopi la purificazione può essere di tipo analitico o preparativo

Letture: purificazione di proteine

Procedura di purificazione

La procedura di purificazione richiede innanzitutto il dosaggio delle proteine totali presenti nella miscela in esame. Tale quantificazione viene generalmente effettuata mediante utilizzo di metodi basati su tecniche ottiche, come la misura dell’assorbimento a 280 nm.
Metodi indiretti, anche basati su tecniche ottiche, sono:
Metodo del biureto: formazione di complessi colorati tra Cu++ ed i legami peptidici (rivelati misurando l’assorbanza a 550nm)
Metodo di Lowry: Biureto e riduzione con acidi fosfomolibdotungstici (rivelazione mediante lettura dell’assorbanza a 750 nm)
Metodo di Bradford: Formazione di complessi tra proteine ed il Coomassie G250. Si forma un prodotto colorato che assorbe a 595nm (composto analogo a quello utilizzato per la colorazione dei gel dopo elettroforesi).

Dialisi

La dialisi è una tecnica che consente di separare una o più molecole disciolte in una soluzione sulla base delle loro dimensioni. La procedura prevede l’utilizzo di una membrana semipermeabile che permette il passaggio selettivo di molecole. Il movimento delle molecole si realizza a partire da una differenza di concentrazione (gradiente) di ciascuna di esse tra i soluti presenti nei due compartimenti, quello all’interno del tubo e quello all’esterno. La diffusione cessa una volta giunti all’equilibrio.

Saggio di attività enzimatica

Per seguire un enzima durante una procedura di purificazione si ricorre al dosaggio dell’attività catalitica. L’attività è espressa in unità internazionali (U): 1 unità corrisponde alla quantità di enzima necessaria alla trasformazione di 1µmole di substrato in 1 minuto.

Per controllare il grado di arricchimento durante una procedura di purificazione si ricorre all’introduzione del concetto di attività specifica (A.S.) di un enzima, che corrisponde alla attività enzimatica normalizzata alla concentrazione totale delle proteine presenti:

A.S. = Attività enzimatica (U/ml) / Concentrazione proteica totale (mg/ml)

L’attività specifica è espressa in U/mg

Dopo ogni stadio di purificazione, se questa ha avuto successo, l’attività risulta concentrata in una parte delle frazioni prodotte, come negli esempi riportati in figura 1. In questo caso la A.S. aumenta in quanto la concentrazione della proteina di interesse aumenta rispetto a quella totale, come avviene nel caso della purificazione di NADH ossidasi riportata in figura 2.

Elettroforesi

L’elettroforesi è largamente utilizzata nel corso di purifcazioni di proteine, in genere come tecnica analitica, per determinare rapidamente la complessità della miscela di proteine ottenuta, come in figura 1.

L’elettroforesi può essere accoppiata al western blot (vedi lezione 11 slide 11) per riconoscere la presenza di molecole specifiche nelle fasi in cui la purificazione non è ancora in grado di metterle direttamente in evidenza come bande separate dalle altre (figura 2). Segui questo link per vedere la procedura in azione.

Multimedia:

SDS PAGE Movie

Western blot Movie

Uso di affinity tags

In molti casi l’introduzione di tag specifici, costituiti da sequenze presenti solo nella proteina di interesse, e capaci di legare in maniera selettiva ligandi specifici, permette la separazione delle proteine contenenti affinity tags per cromatografia di affinità su colonna, in cui i ligandi vengono legati alla resina utilizzata come fase stazionaria. In questo caso la purificazione risulta molto rapida ed efficace.

Esempi di tag con i rispettivi ligandi sono:

  • GST – Glutatione
  • MBP – Maltosio
  • biotina – Avidina
  • Poli-His – Nichel, Zinco
  • Proteina A – Anticorpi

In figura 2 è riportato un esempio di purificazione in singolo step con GST.

Nel caso di His-tag, la fase stazionaria è caricata con metalli bivalenti (Cu++, Zn++ , Co++, Ni++…) cui le le proteine si legano per la presenza del tag. Le proteine legate alla fase stazionaria, possono poi essere eluite variando il pH, o con chelanti dei cationi bivalenti o per competizione (istidina, imidazolo…).

Purificazione di anticorpi

Nella figura è riportato un esempio di purificazione di anticorpi monoclonali. A partire dal sopranatante di cellulle in coltura, in una singola tappa di purificazione, si ottiene la proteina in forma pura, che viene poi verificata mediante elettroforesi in SDS. L’attvità viene determinata mediante saggio di immunodiffusione in agar.

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