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Giovanni Paolella » 22.Strutture di proteine


Biotecnologie cellulari e molecolari

Strutture di proteine

Prof. Giovanni Paolella

Dott. Leandra Sepe

Tipi di strutture

La comprensione della struttura di una proteina è il punto di partenza per studiare la correlazione esistente tra forma e funzione di queste molecole.

La struttura primaria di una proteina è la sequenza degli amminoacidi che la compongono disposti in catena e legati da legame peptidico. Per effetto della formazione di ponti idrogeno, la catena polipeptidica si organizza in strutture secondarie che, a seconda della conformazione assunta, si definiscono alfa-eliche o di beta-foglietti; queste strutture secondarie possono organizzarsi nello spazio in forme più complesse ottenute per effetto di forze di attrazione tra a-eliche e foglietti beta. Infine, in proteine costituite da diverse catene amminoacidiche, ciascuna di esse si organizza nello spazio rispetto alle altre e la proteina intera assume una struttura cosidetta quaternaria.

Amminoacidi e legame peptidico

Gli amminoacidi si caratterizzano per il gruppo che costituisce la catena laterale e possono essere raggruppati sulla base di caratteristiche come il peso molecolare, il pk o il volume occupato.

La catena polipeptidica primaria è il risultato della formazione di legami peptidici tra il gruppo carbossilico di un amminoacido e il gruppo amminico dell’amminoacido che lo segue nella catena; poichè il legame peptidico è planare, le uniche rotazioni possibili lungo la catena polipeptidica, sono quelle che descrivono gli angoli noti come phi e psi. Per ciascun amminoacido, non tutte le combinazioni di angoli sono però possibili, in quanto alcune sarebbero causa di collisioni tra catene laterali di amminoacidi successivi. Il cosiddetto grafico di Ramachandran consente di osservare che, in una proteina, alcune coppie di angoli sono presenti e altre no.

Strutture secondarie

Alcune combinazioni di angoli sono più comunemente associate a determinate conformazioni secondarie della catena polipeptidica: per esempio, le strutture ad alpha elica e quelle a foglietti beta sono ottenute per combinazioni di angoli localizzate solo in alcune aree circoscritte del grafico di Ramachandran.

Per effetto della torsione a carico del Ca, la catena polipeptidica assume conformazioni spaziali che consentono la formazione di legami deboli lungo la catena, in particolare, ciò rende possibile la formazione di ponti idrogeno tra gruppi carbossilici e gruppi amminici di amminoacidi della catena. Se i ponti idrogeno interessano un residuo ogni quattro, la conformazione spaziale assume la forma di un’ alfa-elica , ma tipi diversi di elica sono possibili se i ponti idrogeno interessano un amminoacido ogni 3 (elica 310) o uno ogni 5 (elica π); se invece i ponti idrogeno coinvolgono amminoacidi di catene adiacenti, la struttura secondaria assume la forma di foglietti anche detti beta-sheet.

Strutture di ordine superiore

L’organizzazione spaziale di una proteina nelle tre dimensioni, dipende dall’intervento di interazioni di natura non covalente che coinvolgono regioni differenti della catena polipeptidica; queste interazioni, note come legami deboli, comprendono legami a idrogeno, legami ionici e interazioni di van der Waals. Sebbene ciascuno di questi legami abia una forza molto contenuta, nell’insieme essi contribuiscono a stabilizzare la struttura tridimensionale della catena polipeptidica.

I legami a idrogeno possono coinvolgere coppie diverse instaurandosi tra atomi di due catene laterali, tra catena laterale e catena principale oppure tra due atomi della catena principale.

La struttura terziaria di una proteina può essere rappresentata in modi diversi, alcuni più semplici e altri più complessi, tuttavia essa è sempre piuttosto complessa, già per domini come l’SH2, ancora di più naturalmente per intere proteine.

Analisi di strutture mediante cristallografia

La cristallografia è la tecnica che ha permesso la definizione della struttura delle prime molecole organiche complesse, e, successivamente, delle prime proteine come la insulina e la mioglobina. La tecnica consiste nell’irradiare cristalli con radiazioni a bassa lunghezza d’onda (raggi X) e nel ricostruire la struttura a partire dal pattern di diffrazione.

L’uso di cristalli è essenziale, perchè solo in un cristallo le molecole sono garantite assumere una conformazione regolare: in sostanza le molecole in acqua assumono conformazini e orientamenti molteplicii, mentre un cristallo è costituito da un gran numero di celle elementari ripetute, in cui le molecole sono sempre nella stessa posizione e orientamento, e la definizione della loro struttura diviene quindi possibile.

La produzione dei cristalli è relativamente semplice per molecole inorganiche o per piccole molecole organiche, ma con il crescere della dimensione diviene via via più difficile identificare le condizioni per la cristallizzazione. In un cristallo proteico, l’unità ripetititva contiene a volte, oltre alla proteina, anche alcune molecole diverse come ligandi o altre molecole utili alla cristallizzazione, e, di regola molecole di acqua. La crescita del cristallo inoltre diviene tipicamente una operazione molto lunga, che può durare settimane o mesi, per proteine di dimensioni anche non eccessivamente grandi.

In figura sono riportati esempi di cristalli ottenuti a partire da molecole diverse.

Diffrazione con raggi X

Il cristallo viene irradiato e la diffrazione dei raggi da parte delle nuvole elettroniche contenute nel cristallo genera una figura di diffrazione, che dipende dalla disposizione spaziale degli elettroni. La figura di diffrazione ottenuta viene registrata da diverse angolazioni. Il dato sperimentale è il risultato della combinazione dell’effetto di un gran numero di componenti, che possono essere determinate mediante analisi del pattern con tecniche computazionali. In breve il pattern di diffrazione è la combinazione di diverse componenti, che possono annullarsi se in controfase, o sommarsi se in fase. Il calcolo della trasformata di Fourier, permette di determinarle a partire dal dato sperimentale. Il risultato ottenuto è una descrizione della densità eletronica all’interno della cella elementare del cristallo, che, per molecole complesse come le proteine, deve essere comparata con la struttura primaria, per arrivare alla definizione della struttura tridimensionale. Il grado di risoluzione ottenibile dipende dalla capacità di ottenere cristalli puri e immagini di elevata qualità. Risoluzioni tipiche possono andare da decine a poche unità di Ångstrom: risoluzioni più elevate permettono di definire la posizione di atomi piccoli come gli idrogeni, mentre risoluzioni più grossolane sono utili solo per la definizione dell’orientamento generale dello scheletro della proteina

NMR

La spettroscopia NMR utilizza il principio che le energie dei due orientamenti possibili di un nucleo dipendono dalla forza del campo magnetico applicato. L’assorbimento di radiazione elettromagnetica risulta nella transizione dal livello più basso a quello più elevato. La tecnica permette la risoluzione di strutture relativamentre semplici, come quella dell’etanolo. La tecnica, applicata a molecole più complesse, come una proteina, rende rapidamente complesso, e non direttamente utilizzabile il pattern ottenuto.

L’uso di spettroscopia bidimensionale permette l’estensione del concetto a molecole più complesse. L’effetto Overhauser (NOE), permette di identificare coppie di protoni che risultano vicini nella struttura tridimensioanle della molecola. Uno spettro bidimensionale è schematicamente rappresentato in figura, dalla quale risulta che i protoni 2 e 5 sono sufficientemente vicini da influenzare reciprocamente il pattern.

In figura è riportato l’esempio di una reale proteina di 55 aminoacidi. I picchi fuori diagonale indicano interazioni dovute a breve distanza, e possono essere utilizzati per generare modelli tridimensionali, con l’aiuto della conoscenza della struttura primaria.

Confronto tra cristallografia e NMR

Le due tecniche descritte sono diverse. In generale la cristallografia permette di raggiungere risoluzioni elevate e può essere applicata a molecole più grandi, tuttavia richiede la fase di cristallazione che pone problemi specifici. Non sempre l’ottenimento di cristalli può essere garantito, e, inoltre, le molecole sono essenzialmente ‘congelate’ nella conformazione necessaria all’ottenimento del cristallo. La NMR può essere applicata in soluzione e in condizioni sperimentali diverse, ed è quindi immediatamente disponibile.

Le informazioni ottenute sono quindi essenzialmnte complementari, e, se combinate, contribuiscono entrambe alla generazione di modelli tridimensionali affidabili.

Predizione di strutture secondarie

La relazione sperimentalmente dimostrata tra struttura primaria e conformazione di proteine, apre l’opportunità a tecniche di predizione della struttura tridimensionale sulla base della sequenza aminoacidica. Numerose tecniche sono disponibili, che tengono conto sia di aspetti statistici che termodinamici.

I metodi più semplici si limitano ad osservare la frequenza con cui aminoacidi specifici si ritrovano in segmenti di proteina con ripiegamento ad elica alfa o in foglietti beta (figura 1). La sola presenza di aminoacidi che prediligono l’una o l’altra struttura secondaria, permette di effettuare predizioni anche relativamente affidabili.

In aggiunta, la presenza di più aminoacidi idrofilici è frequentemente associabile ad una ipotetica disposizione della regione in aree esterne della molecola, al contatto con l’ambiente acquoso, mentre il ritrovamento di regioni idrofobiche è indice di tratti transmembrana o di aree interne della molecola (figura 2).


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