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Biotecnologie cellulari e molecolari

Vitalità e proliferazione di cellule in coltura

Prof. Giovanni Paolella

Dott. Leandra Sepe

Prof. Mara Bevilacqua

Colture cellulari

Le colture cellulari sono sistemi semplificati che consentono il mantenimento di cellule in vitro; cellule coltivate in vitro vengono utilizzate sia per lo studio di fenomeni biologici come la crescita e il differenziamento, che per lo studio della struttura e della funzione dei geni mediante manipolazioni genetiche. Disponibilità e relativa economicità, la facile standardizzazione e riproducibilità sperimentale rendono la metodica vantaggiosa, tuttavia, nella valutazione dei risultati, va considerata la notevole semplificazione del sistema sperimentale in vitro rispetto a quello in vivo (per esempio l’esposizione a sostanze esogene avviene in maniera diversa rispetto a quanto si verifica in vivo, inoltre le concentrazioni scelte per lavorare in vitro non sempre corrispondono a quelle fisiologiche dell’organismo in esame). In un sistema in vitro è possibile mantenere cellule di diversa origine, dai batteri ai lieviti fino a colture primarie di cellule animali e linee cellulari; naturalmente cellule di organismi diversi richiedono condizioni di crescita specifiche.

Sono riportati due esempi di linee cellulari eucariotiche, fibroblasti murini NIH3T3 e Caco-2 di adenocarcinoma del colon umano, comunemente coltivate in vitro e fotografate a bassa ed alta densità.

Condizioni di coltura

Poichè all’interno dell’organismo esistono specifici sistemi di controllo che regolano funzioni vitali come nutrizione, controllo del pH, protezione, mantenimento della temperatura, la coltivazione di cellule in vitro deve avvenire assicurando il mantenimento delle stesse condizioni fisico-chimiche, per questo sono fondamentali le funzioni svolte dal terreno di coltura e dagli strumenti usati per l’incubazione.

La prima definizione di terreno di coltura capace di supportare la crescita di cellule eucariotiche si deve a Harry Eagle – 1955. I terreni di coltura per cellule animali contengono normalmente sali inorganici che assicurano cationi e anioni come Na+, K+, Mg++, Ca++, Cl-, indispensabili per la funzione cellulare, glucosio per le funzioni metaboliche legate al fabbisogno energetico, amminoacidi essenziali indispensabili per la sintesi proteica, vitamine coadiuvanti innumerevoli funzioni cellulari e siero che è una fonte di proteine e fattori di crescita in genere indispensabili per la proliferazione.

Il pH del terreno di coltura è tamponato a pH ~7.4 aggiungendo generalmente bicarbonato/acido carbonico. La presenza di un indicatore come il rosso fenolo consente di monitorare il pH del terreno di coltura, il colore giallastro indica infatti un valore di pH acido mentre il rosso-violaceo corrisponde ad un pH basico.

Controllo della temperatura e della CO₂

L’ambiente fisico necessario alla crescita in vitro viene fornito dagli incubatori, strumenti capaci di mantenere temperatura e atmosfera controllate. Le cellule coltivate in vitro richiedono un controllo di temperatura rigoroso almeno quanto quello dell’organismo vivente; cellule di mammifero vengono comunemente coltivate a 37°C, mentre per altri tipi cellulari, come ad esempio cellule di drosophila, l’incubatore deve poter essere regolato a temperature diverse come 30°C o 34°C.

La pressione parziale di CO₂ adatta alla coltura in vitro di cellule animali deve essere vicina a quella misurata all’interno dei tessuti (35-45 mmHg, pari al 4.6- 5.9% di CO₂), per questo motivo l’atmosfera all’interno degli incubatori è costituita al 95% da aria e al 5% da CO₂.

Controllo della sterilità

Le colture cellulari sono sistemi estremamente sensibili e, per maneggiarle, occorrono specifiche competenze e strumentazione in grado di garantire la sterilità. Tutte le attività che richiedono la manipolazione della coltura vengono infatti eseguite sotto una cappa a flusso laminare verticale (figura): l’aria proveniente dall’esterno viene filtrata, in modo da trattenere particelle contaminanti, e spinta dal flusso laminare e da una pressione positiva ad attraversare lo spazio di lavoro in senso verticale dall’alto verso il basso; un sistema cosi’ fatto garantisce che nello spazio di lavoro, dedicato alla manipolazione delle colture, circoli solo aria sterile.

Tutti i materiali che vengono in contatto con le colture devono essere sterili; per materiali come vetreria e metalli si utilizzano stufe a secco, a 150°C, per le soluzioni saline si ricorre alla sterilizzazione in autoclave, mentre si utilizzano filtri con pori da 0.22 μm per le soluzioni contenenti macromolecole o molecole termolabili come i terreni di coltura.

Le contaminazioni che più comunemente colpiscono una coltura cellulare sono dovute a microorganismi, come batteri e micoplasmi, ma anche a lieviti e muffe. La contaminazione batterica è un evento facile da riconoscere perchè provoca una repentina acidificazione e l’intorbidimento del terreno di coltura. Essa provoca danni irreversibili e la coltura deve essere eliminata. Le infezioni da organismi intracellulari come i micoplasmi sono invece molto meno evidenti e, almeno nelle prime fasi, non interferiscono con la vitalità cellulare, anche per questo motivo può essere opportuno intervenire con antibiotici nel tentativo di debellare il contaminante.

Tipi di colture

A seconda che la coltura richieda di aderire ad una superficie o cresca in un mezzo liquido, si distinguono colture adese da quelle in sospensione. Alcuni tipi cellulari, caratterizzati da crescita adesa, per effetto dell’inibizione da contatto, smettono di proliferare quando formano un monostrato. Le superfici di coltura più comuni (figure 1 e 2) sono le capsule di Petri, disponibili in varie misure e composte da materiale plastico trattato opportunamente in modo da esporre cariche negative che favoriscano l’adesione cellulare.

La curva di crescita di una coltura in vitro, espressa come logaritmo del numero cellule in funzione del tempo, inizia con una fase di crescita lenta nota come fase di latenza, continua con una fase di crescita esponenziale e si conclude con la fase di senescenza e morte. La durata di una coltura può variare anche ampiamente: è possibile infatti distinguere colture a breve termine, la cui curva di crescita si conclude dopo un ridotto numero di replicazioni, e colture a lungo termine, in cui le cellule si dividono molte volte prima di morire. Vedremo in seguito che è però possibile intervenire in modo da allungare illimitatamente la vita della coltura; per ottenere questo risultato e’ necessario procedere all’immortalizzazione.

Fig. 1

Fig. 2

Colture primarie

Una coltura primaria viene generata isolando cellule direttamente a partire da tessuti o organi, le cellule isolate in questo modo riflettono meglio le attività biochimiche delle cellule in vivo, tuttavia hanno una vita limitata e, per la realizzazione di progetti a lunga scadenza, è necessario prevedere diversi isolamenti.

Per procedere all’isolamento di una coltura primaria da tessuto occorre tener presente che un tessuto è composto di tipi cellulari diversi, tenuti insieme da matrice; è quindi necessario rompere la matrice per separare le cellule procedendo poi alla selezione dei tipi cellulari necessari per gli scopi sperimentali. La procedura prevede che il campione di tessuto sia trattato con tripsina e collagenasi allo scopo di digerire la matrice extracellulare, e con EDTA allo scopo di chelare il Ca++ da cui dipende l’adesione cellula-cellula. Dalla sospensione cellulare ottenuta si ottiene una coltura primaria. Le cellule della coltura primaria aderiscono alla piastra e crescono fino a coprire tutta la superficie disponibile. A questo punto vengono rimosse dalla piastra di coltura e sistemate in nuove piastre a bassa densità allo scopo di ottenere colture secondarie.

Immortalizzazione

Dopo un certo numero di duplicazioni (variabile per tipo cellulare), le cellule primarie smettono di dividersi e muoiono per effetto dell’accorciamento dei telomeri. Per ottenere una linea cellulare capace di proliferare illimitatamente (linea cellulare continua), è necessario immortalizzare la coltura; esistono diversi metodi per ottenere questo risultato, per esempio:

Introduzione del gene esogeno che codifica per la subunità catalitica della telomerasi
Utilizzo di oncogeni derivati da virus tumorali (antigene T di SV40), che innescano meccanismi di trasformazione simili a quelli che determinano la proliferazione tumorale.

Cellule provenienti da tessuti tumorali sono linee cellulari naturalmente immortalizzate, non a caso la prima linea cellulare continua è stata isolata da George Gey nel 1951 da tessuto tumorale di cervice (Hela).

La possibilità di produrre linee cellulari continue permette di ridurre la variabilità sperimentale legata all’utilizzo di colture primarie garantendo maggiore riproducibilità. Nell’analisi dei risultati occorre però tenere presente che la coltura immortalizzata è in genere più lontana dalle condizioni fisiologiche dell’organismo di partenza.

Esempi di linee cellulari continue

Diverse strutture si sono negli ultimi anni specializzate nella conservazione e propagazione di cellule su larga scala; sono infatti commercialmente disponibili per i ricercatori di tutto il mondo diverse collezioni di linee cellulari, per esempio :

ATCC, American Type Culture Collection
DSMZ, German Collection of Microorganisms and Cell Cultures
ECACC, European Collection of Animal Cell Culture

Ciascuna di queste collezioni fornisce, oltre alla possibilità di acquistare la linea cellulare di interesse, anche informazioni sperimentali a corredo che riguardano sia il protocollo di mantenimento della linea in coltura, ma anche la specie e il tessuto di provenienza, le modalità di isolamento ed altre notizie utili al ricercatore. Per visualizzare le informazioni relative ad alcune delle linee cellulari più comunemente usate in laboratorio, segui i link riportati di seguito:

p-19 , Hela , Huvec , NIH 3T3 , Neuro 2A , PC-12

In aggiunta, va ricordato che alcune istituzioni scientifiche scelgono di gestire una banca cellule interna, nella quale confluiscono linee cellulari provenienti da isolamenti eseguiti nell’ambito di specifici progetti di ricerca, o quelle generate da programmi di manipolazione genetica.