Gaetano Odierna » 3.Allestimento di preparati biologici in microscopia ottica ed elettronica

Tecnica delle fette: prelievo e fissazione

1 – Prelievo: il prelievo dell’organo, solitamente di dimensioni al di sotto del cm³, va eseguito rapidamente, e se necessario, iniettando il fissativo via perfusione.

2 – Fissazione: ha lo scopo di bloccare la lisi delle cellule e dei tessuti e di preservarne il più possibile la struttura.

Tecnica delle fette: inclusione in paraffina

6 – Inclusione in paraffina: viene effettuata in paraffina liquida, mantenuta a 60° in apposite stufe dove, preferibilmente, è possibile effettuare il vuoto.

Preparazione blocchetti: il campione è contenuto in paraffina liquida, contenuta in contenitori prestampati o in lamelle di rame. La paraffina è poi lasciata solidificare a temperatura ambiente per 24 ore.

Tecnica delle fette: sezioni al microtomo

7 – Sezioni al microtomo Il Microtomo: è uno strumento che permette di ottenere fette del campione incluso in paraffina dello spessore di 3-10 μm.

8 – Distensione delle fette su vetrini: si ottiene mettendo le fette sulla superficie dell’acqua portata ad una temperatura tra i 40-50 °C.

Tecnica delle fette: colorazione e montaggio in balsamo

9 – Sparaffinatura in solventi organici: elimina la paraffina dalle fette.

10 – Serie discendente degli alcool e idratazione: viene effettuata gradualmente tramite passaggi in alcol a gradazione decrescente.

11 – Colorazione: può essere dicromica (emallume -eosina; prima immagine) o tricromica (ad esempio tricromica di Mallory; seconda immagine).

12 – Disidratazione: si effettuta tramite il passaggio dei vetrini nella serie ascendente degli alcool.

13 – Chiarificazione: si effettuata tramite il passaggio in solventi organici.

14 – Montaggio in balsamo: consiste nell’interporre uno strato di resina sintetica tra vetrino porta- e coprioggetti.

Tecnica delle fette in Microscopia elettronica

In linea di principio l’allestimento dei preparati biologici in microscopia elettronica segue gli stessi criteri della microscopia ottica. Tuttavia sono previsti importanti modifiche:

• Prelievo: le dimensioni del campione sono di solito dell’ordine di 1-2 mm³. Il prelievo va effettuato a freddo in specifici tamponi.
• Fissazione: è eseguita a freddo con fissativi chimici non coagulanti (es. paraformaldeide, gluteraldeide) a cui segue in genere la post-fissazione in tetrossido di osmio.
• Inclusione: il campione viene incluso in plastica (resine epossidiche).
• Sezioni: si usa l’ultramicrotomo con cui si possono ottenere sezioni ultrafini (80-100 nm). Si usano lame di vetro o di diamante montate su una bacinella con acqua. Le fette ottenute sono raccolte con un retino di rame.
• Colorazione: si usano sali di metalli pesanti (opachi agli elettroni) ad esempio Sali di piombo, di platino, di oro, d’argento, etc.

Particolari tecniche in uso in microscopia elettronica

Colorazione negativa – viene applicata soprattutto per lo studio dei virus e delle macromolecole*.

Il campione, sospeso in un colorante elettrondenso, è applicato su un retino ricoperto da un sottile film di plastica. Si asciuga all’aria e si osserva al TEM. Il colorante riempie gli spazi vuoti, che appariranno scuri, mentre i virus o le macromoleche risultano chiari.

* le tecniche di isolamento e purificazione delle macromolecole (glucidi, lipidi, proteine e acidi nucleici) saranno discusse in specifici corsi, quali ad esempio Biochimica. Consultare anche i capitoli delle tecniche nei libri di testo consigliati dal docente del corso.

Particolari tecniche in uso in microscopia elettronica II

Ombreggiatura al platino – è usato per lo studio delle macromolecole.

1) Il campione è adsorbito su un supporto liscio (lastra di mica). 2) Sotto vuoto spinto e sotto rotazione, sul campione viene proiettato, sotto un angolo di 5°-15°, un sottile strato di platino (elettron-denso) che evapora da un elettrodo al Platino reso incandescente. 3) Lo strato di platino, che rappresenta la replica della superficie del campione,  è stabilizzato da uno strato di carbone fatto cadere dall’alto da un elettrodo di  carbone (elettron-chiaro).  4) la replica di platino è prima trasferita in un bagno alcalino che degrada il campione e, quindi, dopo lavaggio, (5) è trasferita su un retino per l’osservazione al TEM (6).

Particolari tecniche in uso in microscopia elettronica III

Il freeze etching è una tecnica particolarmente usata per lo studio della struttura interna delle membrane cellulari e delle strutture cellulari interne. Il campione, opportunamente crioprotetto (1), è immerso in azoto liquido (2);  in tal modo l’acqua vetrifica. Il campione è immesso sotto vuoto e quindi è inciso da una lama (3). Il piano di frattura prezerenzialmente avviene lungo il doppio strato delle mambrane biologiche (4). La superficie esposta dalla frattura è poi ombreggiata al platino (5) e rinforzata da una strato di carbone. La sostanza organica del campione viene rimossa mediante digestione alcalina e la replica metallica dopo lavaggio è osservata al microscopio elettronico (6).